一种新型黄瓜snp分子标记的制作方法

文档序号:9270996阅读:611来源:国知局
一种新型黄瓜snp分子标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物领域,具体设及一种新型黄瓜SNP分子标记。
【背景技术】
[0002] 黄瓜白粉病是一种广泛发生的世界性病害,是黄瓜主要叶部病害之一。其潜育期 短、流行性强、周年发生,严重影响黄瓜产量与品质。目前,黄瓜白粉病的主要防治措施是化 学防治,但产品农药残留量是不可忽视的安全问题,特别是利用设施栽培后,黄瓜生产的连 作障碍问题越来越严重。因此,选育抗病品种仍是从根本上防治白粉病的有效途径。
[0003] 分子标记技术的出现使人们对于基因的准确检测、目标基因的准确转移成为现 实。研究者们利用AFLP、SSR等分子标记技术,对抗病基因进行了初步的定位,但抗病基因 与分子标记的遗传距离普遍较远,说明黄瓜白粉病抗性分子机理非常复杂,更多科学问题 有待于研究和探索,充分挖掘和利用该些抗性基因,将丰富黄瓜白粉病抗性育种中的抗性 基因资源,并为黄瓜白粉病抗性育种中导入优良抗性基因提供重要基础。
[0004]SLAF-seq(^specificlengthamplifiedfra卵entsequencing)技术是由高通量 测序技术发展而来。通过生物信息学进行实验方案系统设计,构建SLAF-seq文库,筛选特 异长度DNA片段,W高通量测序技术获得海量序列,利用软件进行数据分析比对,获得大量 特异DNA片段,进而依据其序列发展出特异分子标记。SLAF-seq技术具有通量高、准确性 高、成本低、周期短等突出优势,依其测序结果可直接开发大量特异分子标记。该技术可用 于单体型图谱、遗传图谱、关联性图谱、多态性图谱的构建,为分子育种、系统进化、种质资 源鉴定提供重要技术保障。本发明利用SLAF-seq技术开发了一批特异性强、稳定性高的黄 瓜白粉病抗性特异分子标记,为育种中导入抗性优良基因进行分子标记辅助选择提供重要 基础。

【发明内容】

[0005] 为解决上述问题,本发明提供了一种新型黄瓜SNP分子标记,为探索黄瓜白粉病 抗病机理和分子标记辅助选择育种提供了理论依据。
[0006] 为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
[0007] -种新型黄瓜SNP分子标记,所述分子标记的标号为SLAF7695,其核巧酸序列为

[0009] 本发明具有W下有益效果:
[0010] 有助于黄瓜白粉病抗性基因定位,为黄瓜白粉病抗性育种中的分子标记辅助选择 提供依据。
【附图说明】
[0011] 图1为本发明实施例新型黄瓜SNP分子标记的核巧酸序列表。
[0012]图2为本发明实施例中SLAF标签在染色体上的分布图。
[0013] 图3为本发明实施例中第1染色体上深度分布图。
[0014]图4为本发明实施例中多态性标记在各染色体上的分布图。
[0015] 图5为本发明实施例中差异标记在各染色体上的分布图。
[0016]图6为本发明实施例中第1染色体上差异比值整体分布图。
[0017] 图7为本发明实施例中第1染色体差异标记遗传图。
【具体实施方式】
[001引为了使本发明的目的及优点更加清楚明白,W下结合实施例对本发明进行进一步 详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明,并不用于限定本发 明。
[0019] 图1为本发明实施例中分子标记的核巧酸序列表,其中两对引物分别是:
[0020] F; 5'ATGGAGACGACATTGGAAACG3' 580
[0021] R; 5'ATGGAAAAGTGAGTCCGTGA3' 1367
[0022] 本发明实施例中W抗病材料BK2为父本、感病材料H136为母本,根据其接种白粉 病后的抗/感表现,利用BSA法在前期构建的F2群体中,挑取50个抗白粉病和感白粉病的 家系组成抗/感白粉病池。材料均种植于浙江省农业科学院杨渡试验基地。将亲本BK2、 化36及F2群体株系在可调控温度、湿度的智能温室内盆栽。于黄瓜幼苗一叶一屯、期,采用 喷雾接种法,接种浓度为1X104-1X1〇6个抱子/ml。接种后每S天观察、记录一次发病情 况,共记录15天。然后根据抗/感白粉病的表现型结果,挑取高抗和高感的家系各50个组 成抗/感白粉病池。
[002引实施例
[0024] 取两叶一屯、期的材料嫩叶,采用改良的SDS法提取其基因组DM,稀释至60ng/ y心经1%琼脂糖电泳检测浓度。利用酶切预测软件SLAF_Predict系统分析黄瓜基因组, 根据其GC含量、重复序列和基因特点等确定酶切方案、切胶范围及测序量,W保证分子标 记的密度和均匀性。
[00巧]分别取基因组DNA各500ng,加0.抓Mse I(肥B,Hitchin,Hei~ts,UK)、T4DNA连 接酶(肥B)、ATP(肥B)和Mse I接头(肥B)在37°C下反应15h,65°C退火比,然后加限制性 内切酶Hae III和Bfa I在37°C下反应化。反应结束后用如ick Spin column(Qiagen) 纯化酶切产物,并用33yL邸回溶。W回收的酶切产物为模板进行PCR反应,反应体 系25yL,包括模板DNA 100ng、10Xbuffer 2. 5yL、2. 5mmol/L、dNTP 2yL、5U/yL的 Taq DM合成酶(肥B)0. 3yL、10ymol/L Msel引物2yL、d地20加至25yL。PCR产物经 E. Z. N.A.切cle Pure Kit(Omega)纯化后,加入Mse I、T4 DM连接酶、ATP及Solexa接头, 37°C下反应化。利用Quick Spin Column Qiagen)纯化产物,2%琼脂糖胶电泳。利用Gel Extraction Kit (Qiagen)回收琼脂糖胶中230-250bp的条带,并W其为模板,在含化usion Master Mix(肥B)和Solexa引物混合物中进行PCR扩增,扩增产物经纯化后用Illumina GAIIx(mumina,San Diego, CA,USA)测序。
[0026] 每个样品的测序有效数据量需达到50, 000个W上,测序深度5XW上。利用软件 SLAF_Poly.pi.对测序结果进行识别和低质量过滤,得到有效原始DNA序列数据,再利用比 对软件BLAT将各样品有效数据分别进行相似度聚类,并通过深度识别,纠正测序错误,得 到各样品有效序列。
[0027] 参考基因组为黄瓜参考基因组,基因组组装为染色体,基因组经酶切处理打断为 多个小片段,每个片段相当于一个标记位点,同一位点reads序列通过相似性聚类,形成一 个group;group中高深度片段即为潜在基因型,低深度片段可能是测序错误,通过纠错策 略对低深度片段进行纠正,最终获得具有1个或多个等位基因的SLAF标签。根据SLAF标 签的基因组定位结果,统计SLAF标签在各染色体上的数量,绘制SLAF标签在染色体上的分 布图。
[002引对得到的SLAF标签,根据等位基因数和基因序列之间的差异进行多态性分析,获 得多态性标记的类型和数量,对获得的多态性标记根据定位结果,统计其在各染色体上的 分布情况。
[0029] 对获得的多态性标记进行亲本数据标准化,根据亲本测序深度确定等位基因的亲 本来源,选取一种基因型来源于P(H136),另一种基因型来源于M炬K2)的多态性标记。分别 计算两个群体aa、油(感池、抗池)中来源于不同基因型的差异比值(Ratio),根据Ratio_ aa> = 1与Ratio_ab> = 3筛选差异标记,获得差异标记及其在染色体上的数量分布。
[0030] 差异比值计算方法如下:
[0031]Maa表示aa群体来源于M的深度;Paa表示aa群体来源于P的深度;Mab表示油 体来源于M的深度;Pab表示ab群体来源于P的深度;
[0032]Ratio_aa=化a/Maa;当Maa= 0 时Ratio_aa= 1000 ;Ratio_ab=Mab/P油;当 P油=0 时Ratio_ab= 1000。
[0033] 结果与分析
[0034] 采用SLAF-seq技术,获得父本服2、母本化36及抗/感白粉病池的原始序列。经 测序共获得各样品的有效reads为16, 977, 114条,4个样品的Reads数分别达3, 293, 311、 4, 517, 307、5, 073, 477和4, 093, 019,达到预期目标。Reads长度、数量和GC含量的统计结 果见表1。
[0035] 表1样品数据量统计
[0036]
[0037]表中;Sample;样品编号;BMK-ID;样品;Readlength;使用的read长度;Read number;各样品的reads数;GCpercentage;GC含量。
[0038] 测序得到的有效SLAF片段,其DM序列经与黄瓜基因组序列进行比对,获得有效 的SLAF标签数量为73, 100个,整体平均深度为99. 1IX。
[0039] 根据SLAF标签的基因组定位结果,SLAF标签在各染色体上的数量分别为11
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