一种快速鉴定恙虫病立克次体的lamp引物组、试剂盒及方法

文档序号:9270997阅读:628来源:国知局
一种快速鉴定恙虫病立克次体的lamp引物组、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及病原微生物的检测与鉴定,具体设及一种用环介导等温基因扩增技术 (LAMP技术)快速鉴定恙虫病立克次体的方法。
【背景技术】
[0002] 恙虫病,又称为丛林斑疹伤寒,是由恙虫病立克次体导致的疾病,是中国最早发现 的感染性疾病之一。恙虫病立克次体呈短杆状,平均长度1.2um,常见成双排列,寄居于恙 蛾,并可经卵传代。恙蛾幼虫需吸取人或动物的淋己液或血液完成从幼虫到稚虫的发育过 括,町嗦机体后可引起畏窠、发热、町嗦化有焦硫或馈瘍、淋己结肿大、结腸充血、巧疼等临 床症状。恙虫病广泛流行于我国,根据流行时间,可分为夏季型和秋冬型。夏季型主要分布 于南方广东、广西、海南等省份,秋冬型主要流行于江苏、山东等地。恙虫病为散发性的自然 疫源性疾病,自1986年W来,恙虫病由主要在南方流行呈现逐渐向北方扩增的流行态势。
[0003] 恙虫病感染者早期的临床症状与登革热、追疾、伤寒等热带病极为相似。目前针 对恙虫病的病原培养性检测比较困难,常规的血清学分型又有检测耗时长且特异性、灵敏 性差等缺点。巧光PCR等核酸检测方法,虽然提高了检测的灵敏度和特异性,但需要昂 贵的仪器设备。W上各种方法虽然可能在临床上提供较好的诊断价值,但由于其各自的 缺点未能在临床上大规模使用。环介导等温基因扩增技术化oop-MediatedIsothermal Amplification,LAMP)是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术,具 有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点,目前尚未有将LAMP法应用于快速鉴定 恙虫病立克次体。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于提供一组用于快速检测恙虫病立克次体的特异性引物,及一种 用环介导等温基因扩增技术(LAMP技术)快速鉴定恙虫病立克次体的方法。本鉴定方法方 便快捷、价格低廉,适于推广应用。
[0005] 为达到上述目的,本发明所采用的技术方案如下: 用于快速鉴定恙虫病立克次体的特异性引物组,其特征在于,包括: 内引物 1 ;5, -TTGCTACACCAAGTGCTCCTGATATGCTGGTCTTGGTGC-3,(沈QIDNo. 1); 内引物 2:5,-TTAATGCTGCTGAGGGTGTGTCGCATTTACCGAGTACTTATCT-3,(沈QIDNo. 2); 外引物 1 ;5' -TTGATCTGAGTATGATTGTCGG-3'(SEQIDNo. 3); 外引物 2 ;5, -GAAGTTATAGCGTACACCTACA-3'(SEQIDNo. 4); 环引物 1 ;5, -GCAACCATACCTGTATGCC-3'(沈QIDNo. 5); 环引物 2 ;5' -ATGTGGACATAGAAGGTGGTT-3'(沈QIDNo.6)。
[0006] -种用于快速鉴定恙虫病立克次体的RT-LAMP试剂盒,其含有上述的RT-LAMP特 异性引物组。
[0007] 所述引物组中,内引物、外引物、环引物的摩尔比为8 ;1 ;4。
[0008] 所述用于快速鉴定恙虫病立克次体的RT-LAMP试剂盒还包括W下成分;逆转录 酶;(3)DNA聚合酶;RT-LAMP反应液;显色剂;阳性对照和阴性对照。
[0009] 所述逆转录酶为^必鹏转录酶;所述DNA聚合酶为化^DNA聚合酶。
[0010] 所述RT-LAMP反应液含有;lOmMdNTP、10XIliermo化 1 反应缓冲液、150mMM拆〇4、 5mM甜菜碱,四者的体积比为6~8 ;4~5 ;2~3 ;8~10。
[0011] 所述显示剂为SYBRGREENI。
[0012] 所述阳性对照为含有恙虫病立克次体保守序列的基因片段(SEQIDNO. 7)的质 粒,阴性对照为DEPC水。
[0013] 一种快速鉴定恙虫病立克次体的方法,具体包括如下步骤: (1) 提取模板RNA; (2) 利用上述特异性引物组对模板RNA进行环介导等温基因扩增反应; (3) 结果判断;在上述反应管中加入2化显色剂10XSYBRGREENI,混匀后观察反应 液的颜色,若呈现绿色则为恙虫病立克次体,澄色则为非恙虫病立克次体。
[0014] 环介导等温基因扩增反应的25化反应体系含有;内引物1、2各8pmol/化,外弓I 物1、2各1pmol/ML,环引物1、2各4pmol/ML,反应液12. 5ML,DNA聚合酶8U,待检RNA 1~l(K)ng,逆转录酶1U,用灭菌去离子水补齐到25化;环介导等温基因扩增反应的条件为: 60 ~65°C反应 30 ~40min。
[0015] 本发明的有益效果在于;本发明针对恙虫病立克次体TSA56区域特异性设计了 6 条引物,与目的基因的6个区域结合,具有较高的特异性。本发明的试剂盒方便快捷,能在 较短的时间内鉴定恙虫病立克次体,且不需要昂贵的仪器设备;灵敏度高;特异性好,适合 现场检测。
【附图说明】
[001引图1为本发明RT-LAMP试剂盒的阴性与阳性对照品的检测结果(一;阴性对照,+: 阳性对照); 图2为本发明对恙虫病立克次体W及对非恙虫病立克次体的扩增结果(一:阴性样 品,+;阳性样品,1;非恙虫病立克次体样本,2;恙虫病立克次体样品) 图3为实施例2的特异性验证结果(1;阴性,2 ;0.Tsutsugamushi,3 ;I?ickettsia prowazekii,4;Rickettsiamooseri,5;Rickettsiarickettsii,6 ;YFV,7 ;JEV,8 ;HSV,9; EBV,10;DENV2 ); 图4为实施例3的灵敏度实验结果(a;普通PCR扩增结果,b:Real-timePCR扩增结 果,c:本发明RT-LAMP扩增的凝胶电泳结果,d:本发明RT-LAMP扩增的Real-time结果, e:本发明RT-LAMP扩增的显色结果1 :DEPC,2~8:含有恙虫病立克次体特异性TSA56基 因 1. 0、1.OXl0i、l.OXl02、l. 0Xl03、l. 0Xl04、l. 0Xl05、l. 0Xl06 拷贝 /化)。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明,但并不局限于此。
[0018] 实施例1用于快速鉴定恙虫病立克次体的RT-LAMP试剂盒的建立 用于快速鉴定恙虫病立克次体的RT-LAMP试剂盒,包括W下成分;(1)特异性引物组; (2)逆转录酶;(3)DNA聚合酶;(4)RT-LAMP反应液;(5)显色剂;(6)阳性对照和阴性对 照。
[0019] (1)特异性引物的设计: 根据恙虫病立克次体(GenBank登录号为;GU446621. 1)的特异性区域设计6条特异性 引物,序列分别如下: 内引物 1 ;5, -TTGCTACACCAAGTGCTCCTGATATGCTGGTCTTGGTGC-3,(沈QIDNo. 1); 内引物 2:5,-TTAATGCTGCTGAGGGTGTGTCGCATTTACCGAGTACTTATCT-3,(沈QIDNo. 2); 外引物 1 ;5' -TTGATCTGAGTATGATTGTCGG-3'(SEQIDNo. 3); 外引物 2 ;5, -GAAGTTATAGCGTACACCTACA-3'(SEQIDNo. 4); 环引物 1 ;5, -GCAACCATACCTGTATGCC-3'(沈QIDNo. 5); 环引物 2 ;5' -ATGTGGACATAGAAGGTGGTT-3'(沈QIDNo. 6); (2) 逆转录酶为化逆转录酶; (3) DNA聚合酶为化^DNA聚合酶; (4)RT-LAMP反应液含有;lOmMdNTPJOXIliermoPol反应缓冲液、150mMM拆〇4、5mM甜 菜碱,四者的体积比为8 ;5 ;3 ;10。
[0020] (5)显示剂为SYBRGREENI。
[0021] (6)阳性对照为含有恙虫病立克次体基因片段(SEQIDNO. 7)的PMD-19T质粒巧U 用常规的质粒构建方法将SEQIDNO. 7插入PMD-19T质粒中得到)。阴性对照为DEPC水。
[0022] 阳性对照和阴性对照的扩增结果见图1。
[0023] 实施例2恙虫病立克次体的检测方法 (1)提取模板RNA。
[0024] (2)利用实施例1的特异性引物组对模板RNA进行环介导等温基因扩增反应: 25化反应体系含有;内引物1、2终浓度各为8pmol/ML,外引物1、2终浓度各为1pmol/ 化,环引物1、2终浓度各为4pmol/化,反应液
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