酯酶est4、酯酶EST4、重组质粒和基因工程菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，设及醋酶基因、醋酶、重组质粒、基因工程菌株及 其应用。
【背景技术】
[0002] 分子微生物生态学的研究已证明环境中存在大量的未能培养的微生物。某些环境 中采用现有培养技术能够培养的微生物不到1 %，该提示我们超过99 %的微生物尚未能培 养，可见基于微生物分离培养的技术途径开发利用微生物资源受到了极大的限制。近年来 随着宏基因组学技术迅速发展，不仅排除了传统微生物培养方式的缺点，而且可W直接从 环境样品中提取DNA，通过功能筛选和基因组文库的构建获得新的功能基因，从而提高了获 得新生物活性物质的机会，有可能得到具有应用价值的新基因。
[0003] 醋酶和脂肪酶都是駿酸水解酶，被分为8个族。醋酶巧sterases)能够水解少于 10个碳原子的短链脂肪酸的醋键，而脂肪酶（Lipases)则能够水解多于10个碳原子的长链 脂肪酸的醋键。脂肪酶和醋酶是重要的工业化酶制剂品种，可W催化水解、转醋、醋合等反 应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的醋酶和脂肪酶具有不同的催 化特点和催化活力。其中，用于有机合成的具有醋化或转醋化功能的醋酶和脂肪酶的规模 化生产对于酶催化合成精细品化学品和手性化合物有重要意义。
[0004] 外消旋的动力学拆分是迄今为止脂肪酶最为常见的反应。仲醇的酶促拆分是迄今 为止脂肪酶催化拆分最常用的底物。该不仅是因为仲醇在手性合成中的重要性，同时更重 要的是，一般情况下脂肪酶对仲醇特别是芳香仲醇具有非常好的手性识别，具有较好的拆 分效果。手性芳香仲醇是医药、化妆品、农用化学品等领域不可缺少的中间体。
[0005] 在食品、化妆品、酿酒和医药行业应用最广泛的香料物质为祗締醇的脂肪酸醋，如 香茅醇、香叶醇、芳憧醇的脂肪酸醋等。利用天然原料祗締醇大规模的生产香料醋，原料祗 締醇成本较低，因此利用脂肪酶或醋酶作为催化剂，催化祗締醇与酸或者醋发生反应制备 香味成分祗締醋具有重要的应用价值。同时根据美国、欧洲等国的法律规定；经过生物法合 成的香料被视为天然香料，其产品附加值远大于化学法合成香料，因此生物方法合成香料 具有潜在的应用价值。
[0006] 目前，现有技术中还没有从深海污泥中提取醋酶DNA的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的在于提供一种来源于深海污泥的醋酶基因est4、由该醋酶基因 est4编码的醋酶EST4W及该醋酶EST4的应用。
[000引本发明的另一个目的在于提供一种含有来源于深海污泥的醋酶基因est4的重组 质粒和含有该重组质粒的基因工程菌株W及该基因工程菌株的应用。
[0009] 为达到上述目的，本发明的解决方案是：
[0010] 一种来源于深海污泥的醋酶基因est4,其碱基序列如SEQIDNO;1所示。
[0011] 其中，上述的醋酶基因est4所编码的醋酶EST4的氨基酸序列如SEQIDNO;2所 /J、- 〇
[0012] 一种来源于深海污泥的醋酶EST4,其由上述的醋酶基因est4编码，其氨基酸序列 如SEQIDNO;2 所示。
[0013] 其中，上述的醋酶EST4能够用于催化短链酷基底物的水解反应，该短链酷基底物 的碳原子的数目小于10。
[0014] 一种重组质粒，其包含表达载体和上述的醋酶基因est4。表达载体可W优选为 pLLp-OmpA。
[0015] 一种基因工程菌株，其由上述的重组质粒转化大肠杆菌ToplOF'获得，能够用于表 达氨基酸序列为SEQIDNO;2的醋酶，该基因工程菌株的保藏编号为CGMCCNo. 10812。
[0016] 其中，上述的基因工程菌株能够用于催化短链酷基底物的水解反应，该短链酷基 底物的碳原子的数目小于10。
[0017] 另外，上述的基因工程菌株还能用于催化多种芳香仲醇的动力学拆分反应。
[0018] 此外，上述的基因工程菌株还能用于短链祗締醋的催化生成反应。
[0019] 由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
[0020] 本发明从深海污泥中提取了醋酶基因est4,并构建了含有该醋酶基因est4的基 因工程菌株，从而实现了该醋酶基因est4的异源表达，所产生的醋酶EST4具有优良的酶学 特性，催化水解温度范围为20-55°C，水解抑值为5. 0-10. 0,在45°C条件下保温1化仍能保 持80%W上的残余酶活，在纯极性有机溶剂中保存1化仍然保持90%W上的残余酶活。本 发明的醋酶EST4可应用于催化水解醋和酶法合成醋产品生产过程中，其中，基于转醋化反 应，在高底物浓度条件下，该醋酶EST4已成功用于催化合成多种短链祗締醋和动力学拆分 多种芳香仲醇等反应中。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明的纯化的醋酶EST4的SDS-PAGE图。
[0022] 图2为本发明的醋酶EST4的最适水解温度示意图。
[002引图3为本发明的醋酶EST4的最适反应抑示意图。
[0024] 图4为本发明的醋酶EST4的热稳定性示意图。
[0025] 图5为本发明的醋酶EST4的极性有机溶剂耐受性示意图。
[0026] 图6为本发明的醋酶EST4的底物特异性示意图。
[0027] 图7为本发明的醋酶EST4催化合成短链祗締醋的转化率示意图。
[002引 保藏说巧
[0029] 一种表达醋酶EST4的大肠杆菌巧scherichiacoli)菌株已于2015年5月18日 保存在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中屯、（CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo. 10812。
【具体实施方式】
[0030] 本发明提供了一种来源于深海污泥的醋酶基因est4、由该醋酶基因est4编码的 醋酶EST4、该醋酶EST4的应用、含有来源于深海污泥的醋酶基因est4的重组质粒、含有该 重组质粒的基因工程菌株w及该基因工程菌株的应用。
[0031] <来源于深海污泥的醋酶基因est4〉
[003引本发明的醋酶基因est4是从深海污泥中提取的，其碱基序列如SEQIDNO;1所 示。该醋酶基因est4的大小为95化P。
[0033] <来源于深海污泥的醋酶基因est4的提取方法〉
[0034] 本发明的醋酶基因est4的提取方法包括如下步骤：
[0035] (1)、构建深海污泥宏基因组文库
[0036]a.取lOg采集到的深海污泥样品，使用化icentre公司的Meta-G-Nome?DNA IsolationKit,严格按照说明书上的操作，提取并纯化样品DM;
[0037]b.采用纯化后的样品DM、Fosmid载体pCClFOS和大肠杆菌构建宏基 因组文库，具体如下：WCopyControl?FosmidLibraryProductionKitwith pCClFOS?Vector巧picentre，美国）作为载体，WEPI300TM-T1RE.coli作为宿主，将连接 液用瞻菌体包装，转入宿主菌中，然后将感染了瞻菌体的宿主菌涂布于含有12.5yg/ml氯 霉素的LB平板上，37°C培养过夜获得转化子；将平板上的转化子用无菌LB清洗下来，加灭 菌甘油至20% (v/v)作为克隆菌液，然后于-80°C保存。
[0038] (2)、筛选醋酶的阳性克隆
[0039] 将保存的克隆菌液稀释适当倍数，涂布于含0.5% (w/v)经乳化S了酸甘油醋的 LB-氯霉素（12. 5yg/ml)处理后的筛选平板，37°C培养4她后，挑选能形成透明圈且水解活 性较高的菌株lip〇4。
[0040] 做、构建亚克隆文库及筛选阳性亚克隆
[0041] 依据碱裂法，从菌株lipo4中提取化smid质粒，用内切酶Sau3AI片段化，采用琼 脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收2-5化范围内的DNA片段，然后将回收的DNA片段与经BamH I处理的质粒地luescriptIISK(+)连接并转化D册a构建亚克隆文库，将亚克隆文库均 匀涂布于含0.5% (w/v)经乳化S了酸甘油醋的LB-氨节青霉素（100yg/ml)处理的筛选 平板，37°C培养4她后，挑选能形成透明圈的菌株，经划线重复确认，获