一种融合抗菌肽及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种融合抗菌肤，具体设及的是天蚕素抗菌肤B和整素抗菌肤TPI融 合；其制备方法采用食药用菌菌丝体生物反应器生产融合抗菌肤CB-TPI，尤其设及金针 茹、平茹、灵芝和蛹虫草为制备真菌，属于基因工程和生物医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 抗菌肤（AntimicrobialP巧tides)是生物体产生的一种具有强抗菌作用的阳离 子多肤，是生物先天免疫系统的重要组成，它具有广谱性、高效性、稳定性等特点，其本身不 易产生耐药性。它不仅具有杀菌作用，还能抑杀真菌、寄生虫、病毒W及肿瘤细胞，且对正常 细胞毒性较小，因此，抗菌肤极有可能成为一种新的抗生素替代品。
[0003] 天蚕素抗菌肤（cecropins)早在1980年就被发现，它是从蚕蛹中分离得到的第一 个抗菌肤。目前，已经发现超过1700种抗菌肤，而天蚕素是研究最为清楚、效果最为明显的 抗菌肤，是最具潜力的抗生素替代品之一。天蚕素利用N端所带的正电荷与原核细胞的细 胞膜磯脂双分子层密集的负电荷静电相吸，C端柔性的插入疏水区，在两亲性a-螺旋的作 用下，在原核细胞膜上形成4皿的离子通道，离子通道的形成改变了细胞膜内外的渗透压， 细胞膜内物质大量外渗，致细菌细胞死亡，起到杀菌作用。有些天蚕素通过干扰信号传导通 路而间接发生，影响病毒基因转录。天蚕素对大肠杆菌、沙口氏菌、金黄色葡萄球菌等主要 致病菌有很强的杀灭作用。
[0004] 整素是海洋节肢动物一整体内产生的一类抗菌蛋白，抗菌谱广，且具有很高的抑 菌活性，在较低浓度下即可抑制革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的生长，但TachyplesinI 对宿主的细胞无伤害作用。现已知道，整素抗菌作用机制是通过形成通道，选择性破坏细胞 膜来杀灭细菌的，因而不易产生耐药性。实验研究发现，它对多种饲料有害微生物包括致病 性和相对致病性饲料细菌、饲料霉菌等均有高效的杀菌作用，有望成为一种新型高效、环保 的绿色添加剂应用于饲料的保鲜防腐。
[0005] 生物反应器是利用转基因技术或代谢调控技术在生物个体生产高附加值蛋白质 和代谢产物，或者改造植物某种功能成分使之更适于人类利用的一种生物制药和蛋白生产 技术。其中，被称为"天然生物反应器"的植物表达体系正在引起工业和医学界越来越多的 关注，目前已成为生产高附加值的口服疫苗、医用蛋白、单克隆抗体的重要途径，是国外生 物产业的研发热点之一。但目前动植物生物反应器仍然存在转基因困难、生长周期长、分离 纯化困难、成本高及因担屯、基因漂移而造成的环境释放困难等问题。食药用真菌生物反应 器作为动植物生物反应器的完美补充，具有基因转化容易、生长周期短、无需在室外环境中 释放等优点，是具有重要开发价值的生物反应器受体系统。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为提高抗菌肤的抗菌能力而提供一种融合抗菌肤。
[0007] -种融合抗菌肤基因，它的碱基序列如序列表SEQIDNO. 4所示。
[0008] -种融合抗菌肤，它的氨基酸序列如序列表SEQIDNO. 5所示。
[0009] 一种表达载体PCB130NG-C公-W/，它是； 1) 用Hindlll和EcoRI双酶切PCAMBIA1300载体，去除MCS区，经DNA聚合酶Klenow 酶补平后，用T4连接酶连接形成中间载体PCB130-1; 2) 在PCB130-1的SphI位点处引入SEQIDNO. 1所示的基因，包含左右边界序列和多 克隆位点，构建成中间载体PCB130-2; 3) PCB130-2分别在PstI酶切位点处引入真菌特异性启动子GPD，在SacI与EcoRI酶 切位点之间引入Nos终止子，构建成真菌特异性双T-DNA表达载体，命名为PCB130NG; 4) 经甜al和SacI，在PCB130NG中插入SEQIDNO. 4所示的基因。
[0010] 一种食药用真菌菌丝，它是将一种表达载体PCB130NG-CB-TPI，转染至食药用原 生质中，用液体培养基培养菌丝，离屯、收集菌丝，烘干或冻干粉碎。
[0011] 一种融合抗菌肤的生产方法，提取所述的一种食药用真菌菌丝总蛋白，将蛋白上 清液直接加载化s-tag亲和柱中，用50mM/L咪挫洗脱杂蛋白至1-2倍柱体积，再用lOOmM/ L咪挫洗脱表达的融合蛋白，收集并浓缩融合抗菌肤CB-TPI，在23°C条件下解育12小时进 行肠激酶的酶切反应，利用截留分子量为lOKdW上的透析袋进行蛋白透析，将得到的透析 液中的抗菌肤进行浓缩，得到纯化后的融合抗菌肤CB-TPI纯品。
[0012] 一种食药用真菌菌丝在生产动物饲料抗菌及蛋白质添加剂中的应用。
[0013] 本发明提供了一种融合抗菌肤及其制备方法和应用，是将天蚕素抗菌肤B (cecropinB,CB)和整素抗菌肤tachyplesinI(TPI)串联构建了一种融合抗菌肤CB-TP I，通过优化天蚕素抗菌肤a疆因与整素抗菌肤W7基因，主要是适宜真菌表达的密码子 偏爱性，设计合成了所述融合抗菌肤的DNA序列，并将其构建到真菌特异性双T-DNA安全表 达载体中；利用阳G转化法转化食药用菌原生质体，该里设及的真菌主要是金针茹、平茹、 蛹虫草和灵芝，再生后，获得转基因的食药用真菌子实体；利用PCR筛选出只含目的基因而 不含选择标记基因的子实体个体，培养至T2代，获得稳定表达融合抗菌肤7基因的 转基因食药用真菌。提取的融合抗菌肤抗菌能力有显著提高，用量少，不存在耐药性问题， 通过转基因食药用真菌菌丝的发酵培养，制备产融合抗菌肤的转基因菌丝。利用本发明生 产的融合抗菌肤菌丝经过低温烘干，可直接制备成饲料添加剂，省略了蛋白质分离纯化过 程，各批次间质量差异小、产量大、成本低。本开发产品的应用，可W增加畜禽的抵抗力，减 少抗生素的使用，具有广泛的社会效益和经济效益。
【附图说明】
[0014] 图1真菌特异性双T-DNA安全表达载体PCB130NG示意图； 图2PUC57-CB-TPI载体和PCB130NG载体酶切结果； 图3 PCB130NG-CB-TPI菌液PCR鉴定结果； 图4转基因蛹虫草菌丝的PCR检测； 图5转基因蛹虫草的PCR检测。
【具体实施方式】
[0015] 实施例1.真菌特异性双T-DNA安全表达载体的构建 利用PCAMBIA1300载体作为基础载体，首先通过值?/?泪II和公CO况双酶切，去除MCS区， 经DNA聚合酶K1enow酶补平后，用T4连接酶连接形成中间载体pCB130-1。接下来，通过基 因合成技术在中间载体的成姑位点处引入一段序列（SEQIDNO. 1)，包含左右边界序列和 多克隆位点，构建成中间载体PCB130-2。在此载体基础上，通过PCR技术及酶切与连接方 法，分别在A幻酶切位点处引入真菌特异性启动子仿W(SEQIDNO. 2)，在&过与公CO况 酶切位点之间引入Afos终止子（SEQIDNO. 3)，构建成真菌特异性双T-DNA表达载体，命名 为PCB130NG，该载体示意图见图1。
[0016] 实施例2.融合抗菌肤CB-TPI的设计 为了提高抗菌肤的抑菌活性，将天蚕素抗菌肤B(cecropinB，CB)和整素抗菌肤tachyplesinI(TPI)串联一起进行构建，并且将整素抗菌肤的C末端进行酷胺化处理； 同时，为使两个抗菌肤表达后在空间上隔开，在两基因之间添加甘氨酸-脯氨酸Linker;为 便于表达后的检测，在TPI基因的3'末端加上His标签。得到的融合抗菌肤CB-TPI的 氨基酸序列为C序列。
[0017] 实施例3.融合抗菌肤CB-TPI真菌表达载体的构建 根据真菌对密码子的偏爱性，对融合抗菌肤的核巧酸序列进行密码子优化，利用人工 合成方法将该序列（SEQIDNO. 3)插入到载体PUC57上，并在序列两端添加酶切位点思 和&过。
[0018] 将pU巧7-CB-TPI载体和本研究组改造后的真菌特异性表达双T-DNA安全表达载 体PCB130NG(图1)，分别用甜al和SacI酶切（图2)，回收酶切产物后，经连接、转化、鉴定 (图3)，获得融合抗菌肤CB-TPI真菌表达载体PCB130NG-CB-TPI。
[0019] 实施例4.转CB-TPI基因蛹虫草子实体