一种转基因西瓜植株的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物转基因技术领域，具体地，设及一种转化率高的转基因西瓜植株 的制备方法。
【背景技术】
[0002] 从1983年转基因植物诞生W来，植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生 物技术之一。植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，导入到目 的植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优 质等。农杆菌介导的转基因方法是一种天然的植物遗传转化系统，具有易操作、低费用、高 效率、外源基因在转基因植物中的拷贝数低和遗传稳定等独特优点，已成为转基因策略中 的首选方法，在植物的遗传转化中广泛应用。
[0003] 西瓜（Citrulluslanatus(Thunb.)为葫芦科一年生草本，是世界性重要瓜类蔬菜 作物。1994年韩国学者化oi等首次报道，利用农杆菌LBA4404,将卡那霉素化anamycin) 抗性基因和GUS标记基因转入了 2个西瓜品种。随后，许多研究者对西瓜遗传转化进行 了深入研究，将抗病、抗逆、耐贬藏等外源基因导入西瓜，并取得了相应进展。但是西瓜仍 然被认为是很难利用农杆菌介导的转基因技术取得成功转化的物种，且转化效率普遍偏 低。牛胜鸟等（2005)利用西瓜成熟胚子叶将小西葫芦黄化花叶病毒狂ucchiniyellow mosaicvirus,ZYMV)复制酶基因、西瓜花叶病毒（Watermelonmosaicvirus,WMV)复制 酶基因导入西瓜，转化效率为0.17% ;化〇等（2008)报道成功转入bar、吨tll基因，转化 效率为 0. 33 ~1. 16%;Huang等（HuangYC，QiiangCH，LiCH.Transgenicwatermelon linesexpressingthenucleocapsidgeneofwatermelonsilvermottlevirusand theroleofthiamineinreducinghyperhydricityinregeneratedshootsPlant CellTiss化gan化It, 2011，106:21 - 29)报道转移西瓜银斑病外銷蛋白基因的转化效 率为 0.9 ~1.9% ;化等化1TA，QiiangCH，Wu册，etal.Generationoftransgenic watermelonresistanttoZucchiniyellowmosaicvirusandPapayaringspotvirus typeW.PlantCellRep, 2011. 30:359-371)报道将小西葫芦黄化花叶病毒外銷蛋白基因 和番木瓜环斑病毒外銷蛋白基因转入西瓜，种子转化效率为8. 5~10%，（由此推算出其外 植体切块转化效率约为1. 06%~1. 25% )。从已有的报道来看，不同研究者报道结论差异 较大，且普遍转基因频率低下。因此农杆菌介导法转化技术在西瓜上的规模化应用目前还 存在困难，现有技术不能满足开展西瓜功能基因研究及遗传改良的需要。
[0004] 目前西瓜全基因组测序及骨干育种材料的重测序工作已经完成，大量功能基因有 待验证，在此基础上，将全面带动西瓜分子育种工作的快速发展。该个形势下，对建立一个 高效的西瓜转基因技术提出了迫切需求。西瓜是公认的较难转化的作物之一，制约西瓜遗 传转化效率的因素主要是在西瓜转基因过程中，普遍存在共培养结束后因农杆菌过度生长 导致外植体生长不良；转化细胞与再生细胞重叠性低；逃逸体形成频率高，转化芽频率低； 再生株易玻璃化，生根困难等问题。该些问题是导致西瓜外植体转基因植株生产率低的重 要原因，而在多数前人的研究工作中都没有引起足够重视，仅把主要研究点放在了激素种 类及浓度的配比使用上，取得的进展依然有限，该需要从其他方面改进技术，W建立高效稳 定的转基因西瓜的制备方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种转化率高、转基因植株生长健壮、存活率高的转基因 西瓜植株的制备方法。
[0006] 本发明提供的一种转基因西瓜植株的制备方法，包括W下步骤：
[0007] (1)含外源目的基因的农杆菌菌液侵染西瓜成熟子叶外植体；
[000引 （2)侵染后，将外植体转入共培养基中培养，所述共培养基为=层无菌滤纸，加入 液体共培养基浸透滤纸；外植体置于滤纸之上共培养；
[0009] (3)共培养结束后，将步骤（2)的外植体转移到含低浓度筛选剂的筛选培养基上 进行筛选培养，之后逐渐提高筛选剂的浓度进行筛选培养，挑选抗性外植体；
[0010] (4)将抗性外植体幼芽转入芽伸长培养基继续筛选，取生长良好的完整幼苗，转入 生根培养基，幼苗生根后炼苗、移栽，得到转基因西瓜植株。
[0011] 本发明方法中，步骤（1)所述的西瓜子叶外植体获得方法为：取健康饱满的西瓜 种子，剥去种皮，避免伤及种仁，用70%己醇溶液消毒30sec，无菌水清洗；有效氯浓度为 0. 2% -0. 3%的次氯酸钢溶液消毒10-15min，无菌水清洗后接入BM培养基，28°C暗培养3 天，切取健康萌动的种仁，自子叶近轴端，1. 5mmX1. 5mm切片，及时接入MS液体培养基中。
[0012] 本发明方法中，步骤（1)侵染方法为将OD600为0. 8-1. 0的含外源基因的农杆菌 菌液与西瓜子叶外植体混匀，侵染lOmin。
[0013] 本发明方法中，步骤（2)所述的共培养是在28°C黑暗条件下培养4天。
[0014] 其中，步骤（2)所述共培养基的配方为1650mg/L NH4N〇3，1900mg/L KN〇3，170mg/ L KH2P〇4,370mg/L MgS〇4.7H2〇,332mg/L CaCl2, 223mg/L MnS〇4. 4&0,6. 2mg/L &8〇3,8.6mg/ L ZnS〇4. 7&0,0. 83mg/L KI，0. 025mg/L P'JasMoO*. 2馬0,0. 025mg/L OiS〇4. 5馬0,0. 025mg/ L C0CI2.6&0,27.8mg/L FeS〇4. 7&0 37. 3mg/L EDTA.化2，1000mg/L肌醇5mg/L烟酸，5mg/ LVBi，0. 5mg/L VBe，1. 5mg/L6-BA，30g/L庶糖，6g/L琼脂（液体共培养基不加琼脂），p册.8， 118°C，20min高压灭菌；
[0015] 所述液体共培养基的配方为上述固体培养基配方中不含琼脂。
[0016] 其中，步骤（2)的加入液体共培养基的量应同时满足W下条件，即刚好浸润滤纸 且无多余液体流出并保证28°C共培养4天后滤纸不干涧。
[0017] 本发明方法的步骤（3)中，选择除草剂为筛选剂，优选地，选择草锭麟（PPT， Phosphinot虹icin)为筛选剂。
[0018] 进一步地，步骤（3)的具体方法为，共培养结束后，选择正常膨大的黄色子叶切片 外植体直接转入含3-3. 5mg/L草锭麟和300mg/L駿节青霉素的筛选培养基，筛选培养2-3 周后，将抗性外植体转入含4. 5-5. 5mg/L草锭麟和300mg/L駿节青霉素的筛选培养基，继 续筛选培养2-3周，当抗性外植体在切口边缘有绿色瘤状愈伤生成并分化出不定芽时，将 不定芽切下转入含6. 5-7. 5mg/L草锭麟和300mg/L駿节青霉素的筛选培养基继续培养2-3 周。
[0019] 优选地，步骤（3)的具体方法为，共培养结束后，选择正常膨大的黄色子叶切片外 植体直接转入含3mg/L草锭麟和300mg/L駿节青霉素的筛选培养基，筛选培养2周后，将抗 性外植体转入含5mg/L草锭麟和300mg/L駿节青霉素的筛选培养基，继续筛选培养2周，当 抗性外植体在切口边缘有绿色瘤状愈伤生成并分化出不定芽时，将不定芽切下转入含7mg/ L草锭麟和300mg/L駿节青霉素的筛选培养基继续培养2周。
[0020] 本发明方法中，步骤（4)是将抗性外植体幼芽转入芽伸长培养基继续筛选2-3周， 每周继代一次，将不定芽基部残留外植体和瘤状愈伤逐渐切除，使芽与培养基充分接触。
[0021] 其中，步骤（4)中，转入生根培养基后的培养条件为2000LUX，12小时/天； 25-28 °C。
[0022] 步骤（4)所述的移栽，是指待植株发育正常，小屯、取出再生苗，洗净根部琼脂，移 栽到事先灭菌的草炭；胚石；园±为1:1:2(V/V/V)的基质中，附上薄膜注意保湿，成活后移 栽到温室常规管理。
[0023] 本发明所述的含外源基因的农杆菌为本领域公知的通过基因工程方法转化得到 的含有外源目的基因的农杆菌。在本发明的实施例中，采用的农杆菌菌株类型为EHA105或 C58。
[0024] 本发明方法还包括对筛选得到的除草剂抗性西瓜植株进行PCR鉴定，鉴定的目标 基因为农杆菌转化的外源目的基因。
[0025] 本发明提供了上述方法在西瓜遗传改良及育种中的应用。
[0026] 基于本发明的上述技术方案，本发明方法的优点表现在：外植体细胞活力高，生 长能力强，转化细胞数目多，转化细胞与再生细胞重叠性