一种检测不同种类硫酸盐还原菌的方法

文档序号:9271067阅读:571来源:国知局
一种检测不同种类硫酸盐还原菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及到硫酸盐还原菌(SRB)的检测,具体为一种基于磁性微球及寡核巧酸 探针检测不同种类硫酸盐还原菌的方法。
【背景技术】
[0002] 21世纪为海洋的世纪已成为共识,海洋中除了生物资源W外,各类矿产(如石油、 天然气、硫横、锡等)、稀有元素等储量丰富,因此海洋开发前景十分诱人。然而,随着海洋 资源的开发,海上钢铁设施越来越多,腐蚀与防护问题逐渐暴露出来,成为制约海上设施安 全性的重要因素之一。金属材料在海水环境中的腐蚀是一个设及物理、化学、生物、气象等 因素的复杂电化学过程。其中,生物腐蚀造成的损失占总体腐蚀损失的20%左右,海洋微 生物的代谢产物可吸附在钢铁表面而破坏海洋工程钢铁设施,造成海洋工程环境微生物腐 蚀,给国民经济造成巨大的损失。
[0003] 硫酸盐还原菌(SRB)是一类能够通过新陈代谢将硫酸根离子或亚硫酸根离子转 化为硫离子并获得能量的微生物,是海洋环境中最重要的腐蚀微生物,由SRB引起的腐蚀 占所有微生物腐蚀的1/2。正是因为SRB在各类环境中广泛的存在及它的危害,对环境中 SRB的检测和监控显得非常重要。
[0004] 传统SRB检测方法是培养法,如最大可能数法(MPN),该方法利用梯度稀释培养来 检测SRB种群的数量,但该方法耗费时间长,难W实现多样品监控;另外有直接检测SRB特 征化合物(包括=磯酸腺巧,特异性还原酶硫离子等)的方法,但此类方法存在灵敏度低的 问题;基于SRB细胞检测方法包括酶联免疫吸附反应巧LISA)、凝集反应等,该类方法均基 于抗体与抗原的特异性反应,但此类方法常常存在非阳性反应,使得检测的特异性大打折 扣,另外,W上方法均不能对不同种类的SRB进行区别性检测。为克服该一难题,本发明选 择基于SRB遗传标志的检测方法,提取不同种类SRB所特有的DNA片段为目标检测物,间接 对SRB进行检测,实现了高度的特异性。

【发明内容】

[0005] 本发明目的在于保护一种检测不同种类硫酸盐还原菌的方法。
[0006] 为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
[0007] 一种检测不同种类硫酸盐还原菌(SRB)的方法,利用基于磁性微球及寡核巧酸探 针对不同种类SRB特异性DNA片段为目标检测物,间接对SRB进行巧光检测。
[000引所述磁性微球及寡核巧酸探针为亲和素修饰的磁珠与生物素修饰的捕获探针DNA1、信号探针DNA2,化及不同种类硫酸盐还原菌特异性DNA杂交获得;
[0009] 其中,磁性微球-捕获探针DNA1与目标检测物DNA链部分片段结合形成双链,目 标检测物DNA单链未结合部分与DM2信号探针结合。
[0010] 具体如图5所示;
[0011] 生物素修饰的捕获探针DNA1与信号探针DNA2优选为:
[0012] 检测食氨酸脱硫弧菌,生物素修饰的捕获探针DM1为biotin-AAAAAAAAATACGGA TT巧' -3');
[001引 信号探针DNA2 为CACTCCTAAAAAAAAA-6-FAM巧' -3');
[0014] 检测致黑脱硫肠状菌,生物素修饰的捕获探针DNA1为biotin-AAAAAAAAAGGGACG CG巧' -3');
[0015] 信号探针DNA2 为GACCCATAAAAAAAAA-切5 巧' -3')。
[0016] 所述杂交条件为将磁性微球-捕获探针、巧光信号探针及不同浓度SRB特异性DNA 片段按1:1:1的体积比混合,于37-40°C摇床解育30-60分钟;
[0017] 所述不同种类硫酸盐还原菌特异性DNA为将SRB种群于SRB选择性培养基上在 25-40°C,隔绝空气条件下进行富集,然后将SRB细菌进行清洗并利用细菌基因组DNA提取 试剂盒提取细菌DNA;
[001引 W利用不同种类的SRB特异性引物对上述提取的细菌DNA进行聚合酶链式反应 (PCR)扩增得到细菌特异性DNA片段。
[0019] 所用SRB选择性培养基配方为;1升陈海水中加入0. 4-1. 0克化S〇4,0. 2-0.6克 K2HPO3,1. 0-2. 0 克畑典1,0. 1-0. 5 克CaCls,1. 5-4. 0 克MgS〇4,1. 0-3. 0 克酵母浸出膏,3-5 毫升乳酸钢。
[0020] 所述聚合酶链式反应用量为模板0臟,5.0-6.0^1^;超纯水,10.0-16.0^1; 聚合酶缓冲溶液,1. 0-3. 0yL;S磯酸碱基脱氧核巧酸(dNTPs),0. 5-1. 0yL;上游引 物,1. 0-2. 0yL;下游引物,0. 5-2. 0yL;耐热DM聚合酶,0. 2-0. 5yL;或所述上下游引物 的用量相反;
[002U 反应条件为;复制起始(94°C,5-lOmin) ;35个循环变性(94°C,30-60S),退火处 理(55°C,30-60S),延伸(94°C,30-60S);终止(72°C,7-lOmin)。
[002引所述巧光检测是将信号收集于流失细胞仪炬DFACSAriaII),激光光源为25mW, 639nm,分析速度为lOOOOevents/s。
[0023] 本发明所具有的优点:
[0024] 本发明方法基于磁性微球及寡核巧酸探针对不同种类的SRB特异性DNA片段进行 检测,与传统检测方法相比,该方法特异性强,可实现不同种类SRB种群的鉴定及检测;同 时基于磁性微球及寡核巧酸探针对提取的不同种类SRB所特有的DNA片段为目标检测物, 间接对SRB进行检测,具有高度特异性。
【附图说明】
[0025] 图1为本发明实施例提供了基于磁性微球及寡聚核巧酸探针对不同种类SRB进 行检测的方案图。
[0026] 图2为本发明实施例提供了基于磁性微球及寡聚核巧酸探针对食氨酸脱硫弧菌 DNA片段捕获并结合信号探针后的巧光呈像图。
[0027] 图3单链DNA信号探针检测细菌的标准曲线图(菌种浓度为2X104, 5X104, 1X1〇5, 5X1〇5,1X1〇6, 5X1〇6,1X1〇7, 5XlO'cfu.mL_i)
[002引图4为本发明实施例提供了基于磁性微球及寡聚核巧酸探针对两种不同种类SRB DM片段检测的巧光光谱图。(a,b,c,d依次为空白样,目标样,对比样,目标样与对比样混 合样品,其中,目标样为致黑脱硫肠状菌的特异性DM片段,对比样为食氨酸脱硫弧菌的特 异性DNA片段)
[0029] 图5为磁性微球及寡核巧酸探针与硫酸盐还原菌特异性DNA杂交图。
【具体实施方式】
[0030] 下面通过实施例对本发明做进一步说明。
[0031] 实施例1
[0032] 基于磁性微球-寡核巧酸探针对食氨酸脱硫弧菌进行检测:
[0033] 1)提取食氨酸脱硫弧菌的特异性DNA片段
[0034] 取含有食氨酸脱硫弧菌的水溶液(4~6血)加入到200mL培养基中,培养3~4 天,将细菌进行离屯、分离(离屯、速度为8000-10000转/分钟,离屯、时间8-10分钟)后,将 上层液吸出倒掉,取下层SRB细胞沉淀用细菌基因组DNA提取试剂盒处理。提取纯化得 到的DNA依次与化qDNA聚合酶及特异性引物混合进行PCR扩增反应,用量如下;DNA模 板,5yL;超纯水,15. 8yL;聚合酶缓冲溶液,2. 5yL;dNTPs,0. 5yL;引物1,0. 5yL;弓I 物2, 0. 5yL;taq聚合酶,0. 2yL。热循环温度如下:预变性(94°C, 5min) ;35循环,变性 (94°C,30s),退火(55°C,30s),伸展(94°C,30s);终止(72°C,7min)。
[0035] 2)磁性微球-寡聚核巧酸捕获探针的构建
[0036] 试验中所用到的亲和素修饰的磁性纳米微球(1. 02ym,lOmg.m。)购买于挪威英 杰生命科技有限公,所需的人工合成寡聚核巧酸值Ml,DM2)由上海生工生物工程有限公 司合成。
[0037] 所述DNA序列为DNA1 ;biotin-AAAAAAAAATACGGATT巧' -3,),DM2;TCACTCCTAA AAAAAAA-6-FAM巧' -3' );
[003引首先,取lOuL亲和素修饰的磁珠用磁珠清洗溶液重复清洗四次后定容至ImL; 其次,将亲和素修饰的磁珠与生物素修饰的捕获探针DM1混合,具体结合比例为;ImL, lOmg.mL-i磁珠对应1血,5nMDM1,反应条件为25°C,150转摇床2小时。反应结束后,用 磁珠清洗溶液重复清洗结合DNA探针的磁珠四次并将其最终定容到ImL反应缓冲溶液中即 得到基于磁性微球
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