慢性心力衰竭相关的血清miRNA及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及多种内源性的非编码小RNA的新医药用途，更具体地说设及8种 microRNAs在慢性屯、力衰竭疾病的诊断和预后评估中的用途，属于屯、血管疾病的诊断、预防 和治疗领域。
【背景技术】
[0002] 慢性屯、力衰竭是不同的屯、血管疾病发展到终末阶段的临床综合征，主要病理生理 特点为屯、室充盈和射血能力受损，最后导致屯、室累血功能低下，其预后不良，死亡率高，是 威胁人类健康和导致医疗负担增加的最主要病因之一，对于人口老龄化日益加重的中国来 说尤为重要。到目前为止，W利尿剂、ACEI和0受体阻滞剂为基础的治疗药物组合对部分 患者无效或效果不理想，新的治疗措施亟待发掘；另一方面，慢性屯、力衰竭的危险因素并未 完全阐明，因此需要寻找新的危险因素和采用更加有效的风险评估方法。
[0003] 微小RNA(microRNA，miRNA)是一类新发现的在多种生物进程中具有重要调控作 用的非编码RNA，是来源于内源性发夹结构转录本的长度大约为22个核巧酸的单链RNAs。 通常miRNA作为引导分子，与祀mRNA的3'UTR碱基互补结合，介导基因转录后调控。大多 数情况下，miRNA与祀mRNA结合后将抑制蛋白质翻译并激活核酸外切酶降解mRNA，若miRNA 与祀mRNA高度互补结合则可激活核酸内切酶活性。在复杂的病理生理过程中，miRNA或 miRNAs簇协同参与多级调控是miRNA重要的生物学特征之一；也是针对miRNA的应用治疗 的理论基础之一。与传统的单祀点药物治疗相比，miRNA治疗可W在单个核巧酸分子祀点 治疗的情况下，从多个水平调控疾病病理生理状态，达到更有效的治疗效果。
[0004] 已有研究表明miRNAs可被细胞分泌至外周血循环，并稳定存在，可作为各类疾病 的新的诊断标志物。且RNA干扰技术作为具有突破性临床应用前景的生物技术，从出现开 始的短短数年间就有多个产品进入临床试验，获得了巨大的成功。但是否存在一类miRNAs 在慢性屯、力衰竭诊断和预后评估中具有生物标志物作用，通过检测该类miRNA能为慢性屯、 力衰竭诊断和预后提供新的策略仍是对该领域科研人员的挑战。有研究者对慢性屯、力衰 竭患者外周血miRNAs表达谱进行过筛查（Circulation. 2014 ; 129巧）：1009-21 ;Proc化tl AcadSciUSA. 2014:111(30): 11151-6)，也有研究者对慢性屯、力衰竭患者治疗前后外周 血miRNAs表达谱进行过检测巧urJHeart化il. 2013:15(11): 1277-88)，但没有对相同 患者屯、肌组织和外周血的miRNAs同时进行检测和比较，且缺乏相应的流行病学随访研究。 本发明中，申请人原创性的对相同患者屯、肌组织和外周血的miRNAs同时进行检测和比较， 并对部分患者的病情发展进行了流行病学随访研究。确定了外周血miRNAs表达谱作为慢 性屯、力衰竭疾病诊断和预后生物标志物中的作用。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服现有理论和技术的不足，确定在慢性屯、力衰竭 中起诊断和预后生物标志物作用的外周血miRNAs。
[0006] 本发明人通过大量的实验发现，不仅获得了可w作为生物标志物用于诊断慢性屯、 力衰竭患者外周血miRNAs表达谱，还获得了慢性屯、力衰竭患者屯、肌miRNAs表达谱。同时， 本发明人发现同一慢性屯、力衰竭患者外周血miRNAs表达谱与其屯、肌中的miRNAs表达谱并 不完全一致，提示单纯比较正常人和患者外周血miRNAs将得到非特异性生物标志物。另一 方面，本发明人发现部分外周血miRNAs，例如hsa-miR-665或hsa-miR-660-化，与慢性屯、力 衰竭患者屯、功能呈显著相关性，不仅可用于诊断，还可作为生物标志物用于提示预后。
[0007] 具体的，本发明提供一种可用于诊断慢性屯、力衰竭患者的miRNAs生物标志物。 [000引优选的，所述外周血miRNAs生物标志物为hsa-miR-4491、hsa-miR-1285-3p、 hsa-miR-665、hsa-miR-660-3p、hsa-miR-206、hsa-miR-1268b、hsa-miR-130a_3p和 / 或 hsa-miR-330-化，其序列结构分别如SEQ ID No. 1-8所示。
[0009] 本发明还提供一种可用于评估慢性屯、力衰竭预后的外周血miRNAs生物标志物。
[0010] 优选的，所述miRNAs生物标志物为miR-1285-3p、hsa-miR-665和/或 hsa-miR-660-化，其序列结构如SEQ ID No. 2、3和4所示。
[0011] 本发明还提供一种上述miRNAs生物标志物用于评估慢性屯、力衰竭预后的用途。
[0012] 本发明还提供一种用于检测上述miRNAs序列的试剂，其中，所述序列包括SEQID No. 1，2,3,4,5,6,7 和 / 或8。
[0013] 优选的，所述miRNAs序列为SEQIDNo. 2、3和/或4。
[0014] 优选的，所述的试剂为所述miRNAs序列的逆转录引物和扩增引物。
[0015] 更优选的，所述引物根据下列引物设计原则获得；1)基于茎凸环结构设计的的特 异性逆转录引物与miRNA3'端序列结合，在逆转录酶作用下进行针对特定miRNA的特异性 逆转录反应；2)基于逆转录引物序列设计的特异性正向PCR引物、通用反向引物。
[0016] 本发明还提供一种上述试剂在制备诊断或者评估慢性屯、力衰竭患者预后的试剂 盒中的用途。
[0017] 优选的，所述的慢性屯、力衰竭包括先天性屯、脏病、冠屯、病、急性屯、肌梗死、风屯、病、 高血压、屯、律失常、各种病因导致的屯、肌炎、屯、肌病等病因导致的慢性屯、力衰竭。
[001引本发明还提供一种诊断或者评估慢性屯、力衰竭患者预后的试剂盒，其特征在于， 其中，所述试剂盒包括上述任一所述的试剂。
[0019] 优选的，所述的慢性屯、力衰竭包括先天性屯、脏病、冠屯、病、急性屯、肌梗死、风屯、病、 高血压、屯、律失常、各种病因导致的屯、肌炎、屯、肌病等病因导致的慢性屯、力衰竭。
【附图说明】
[0020] 图1.慢性屯、力衰竭患者外周血miRNAs巧片表达谱及屯、肌miRNAs巧片表达谱分 析；图1A为屯、肌组织miRNAs巧片表达谱散点图；图1B为外周血miRNAs巧片表达谱散点 图；图1C为屯、肌组织miRNAs巧片表达谱火山图；图1D为外周血miRNAs巧片表达谱火山 图。
[0021] 图2.外周血miRNAs巧片表达谱与屯、肌组织miRNAs巧片表达谱比较结果；图2A 为屯、力衰竭时屯、肌组织巧片中均表达升高的miRNAs的变化值，及其在外周血巧片中的表 达改变情况；图2B为屯、力衰竭时屯、肌组织巧片中均表达下降的miRNAs的变化值，及其在外 周血巧片中的表达改变情况。
[002引图3.采用Real-time PCR法验证巧片筛查结果，其中为八种微小RNA(microRNA，miRNA)在慢性屯、力衰竭和正常对照人群血浆中的相对水平（*表示与对照 组相比，p<0. 05 ;**表示与对照组相比，p<0. 01)。
[002引图4.8种miRNAs诊断慢性屯、力衰竭的灵敏度。图4A为ROC值，血浆miRNAs诊 断慢性屯、力衰竭的灵敏度；图4B为与超声检测屯、功能比较的结果，血浆miRNAs含量与屯、脏 超声射血分数相关性。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但该些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可W对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但该些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0025] 实施例1.慢性屯、力衰竭患者外周血及屯、肌组织miRNAs筛查结果
[0026] 1.收集10例慢性屯、力衰竭（取自2007-2014年在屯、血管内科住院患者，每个 病例均由两个或W上临床医师确诊分类）及10例正常对照者外周血样本。取材后，室 温3, 50化pm离屯、6min，取上层血浆，保存于-80 °C冰箱。每0. 25ml外周血血浆中加入 1mlTRIZOLLS(Invitrogen公司），提取RNA，RNaseyMiniKit(Qiagen)处理样品。使用 Nanodrop?ND-1000 检测RNA质量。miRCURY?ArrayPower1 油elingkit巧xqion)标 记后，在杂交工作站进行杂交实验。AxonGenePix4000Bmicroarrayscanner扫描获得 巧片图像。GenePixproV6.0软件分析获得数据，利用microarray技术高通量筛选出在 中差异性表达的miRNA谱。该巧片检测miRNAs共3100种，筛选出差异性表达miRNAs599 个，其中347个miRNAs在屯、力衰竭患者外周血中表达升高，252个miRNAs在屯、力衰竭患者 外周血中表达下降。
[0027] 2.收集1中慢性屯、力衰竭患者（取自2007-2014年在屯、血管内科住院患者，每个 病例均由两个或W上临床医师确诊分类）的屯、肌组织，及10例正常对照者外周血样本。取 材后，室温3, 50化pm离屯、6min，取上层血浆，保存于-80 °C冰箱。每0. 25ml外周血血浆中 加入 1mlTRIZOL(Invitrogen公司），提取RNA，RNaseyMiniKit(Qiagen)处理样品。使 用Nanodrop?ND-1000 检测RNA质量。miRCURY?ArrayPower1 油elingkit(Exqion) 标记后，在杂交工作站进行杂交实验。AxonGenePix4000Bmicroarrayscanner扫描获得 巧片图像。GenePixproV6.0软件分析获得数据，利用microarray技术高通量筛选出在中 差异性表达的miRNA谱。该巧片检测miRNAs共3100种，筛选出差异性表达miRNAs74个， 其中51个miRNAs在屯、力衰竭患者屯、肌组织中表达升高，23个miRNAs在屯、力衰竭患者屯、肌 组织中表达下降。
[002引结果表明慢性屯、力衰竭时屯、肌组织中miRNAs表达发生改变。
[0029] 实施例2.慢性屯、力衰竭患者外周血miRNAs巧片表达谱及屯、肌miRNAs巧片表达 谱分析
[0030] 采用生物信息学分析方法对获得的巧片数据进行分析和处理。
[0031] 1.散点图反应了巧片间或者组间的重复性，重复性越好越靠近对角线。另外使用 化arson相关系数衡量重复性，相关系数越接近1重复性越好。图1A和1B结果表明；巧片 完成质量可靠，重复性好。
[0032] 2.组间比较的情况见图1C和1D。W-log(Pvalue)为纵坐标，1〇肖2(化1(1change) 为横坐标对每一个miRNA作图，可W直观地看到显著性差异的miRNAs(灰色点代表通过 Foldchange和P-value筛选的miRNAs)。图1C和1D结果表明；miRNAs可作为一类慢性 屯、力衰竭诊断的候选生物标志物。
[0033] 实施例3.外周血miRNAs表达谱与屯、肌组织miRNAs表达谱比较结果
[0034] 将外周血巧片和屯、肌组织巧片筛查获得的差异性表达的作为慢性屯、力衰竭诊 断的候选生物标志物的所有miRNAs的变化趋势进行分类。结果表明