一种制备脂肪二酸衍生物的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种制备脂肪二酸衍生物的方法及其应 用。
【背景技术】
[0002] 脂肪二酸衍生物在第三代胰岛素药物尤其是长效胰岛素类似物的研究中发挥着 重要作用，甘精胰岛素作为长效胰岛素类似物的重镑药物在2014年全球销售额达到72. 79 亿美元。然而，甘精胰岛素难以达到平稳地控制血糖和稳定的药物动力学曲线，直接导致低 血糖发生率尤其是夜间低血糖发生率偏高，危及生命。
[0003] 近年来作为甘精胰岛素替代药物的长效胰岛素类似物的研究逐渐成为糖尿病 治疗领域的热点，其中公开号为CN1829738、名称为"新型胰岛素衍生物"的中国发明 专利公开了脂肪二酸侧链通过谷氨酸修饰的长效胰岛素类似物一一德谷胰岛素；公开 号为CN102065884、名称为"聚乙二醇化的赖脯胰岛素化合物"的中国发明专利公开了 分子量约20kDa的聚乙二醇缀合的胰岛素类似物；公开号WO2011/122921的PCT申 请公开了与免疫球蛋白Fc片段通过PEG偶联的胰岛素缀合物。Thibaudeau和Bridon 公开了血清白蛋白偶联的胰岛素缀合物（Thibaudeau和Bridon等人，Bioconjugate chemistry，2005, 16, 1000-1008)，在文章中作者声称该缀合物可以成为潜在的长效胰岛素 类似物候选药。
[0004] 在诸多长效胰岛素类似物研究中，德谷胰岛素半衰期最长，体内作用时间超过42 小时，同时低血糖风险尤其是夜间低血糖风险低，最有希望成为继甘精胰岛素之后的又一 重镑药物。德谷胰岛素（Degludec，商品名为Tresiba)的分子结构式如式I所示，其分子结 构特点在于长链脂肪二酸通过一个谷氨酸分子连接在胰岛素B29位赖氨酸残基上。
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[0006] 长链脂肪二酸衍生物的制备及修饰反应成为了胰岛素类似物制备工艺中的重要 环节。在诺和诺德公司专利号CN1829738公开的十六烷二酸一叔丁酯制备工艺中采用了 N，N-二甲基甲酰胺二叔丁基缩醛作为叔丁酯化试剂，成本高，不适合工业放大；十六烷二 酸琥珀酰亚胺基叔丁基酯制备工艺中采用了 2-琥珀酰亚胺基-1，1，3, 3-四甲基脲四氟硼 酸酯（TSTU)，成本高，不适合工业化放大生产；同时该专利公开了十六烷二酸单甲酯衍生 物，由于该工艺制备的胰岛素类似物需要在0.2MNaOH溶液中脱甲酯，容易引起胰岛素肽 链的分解，杂质较多，同样难以实现工业化放大生产。Grinstaff和Zhang公开了 4-二甲氨 基吡啶（DMAP)催化二环己基碳二亚胺（DCC)缩合十二烷二酸和叔丁醇，制备十二烷二酸一 叔丁酯的工艺（Grinstaff和Zhang等人，Bioconjugatechemistry, 2011，22 (4)，690-9)， 而用该工艺制备十六烷二酸一叔丁酯生成的副产物十六烷二酸N-酰基脲比例高，难以和 产物分离，同样不适合工艺放大生产。
【发明内容】
[0007] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种制备脂肪二酸衍生 物的方法。该方法操作简便、产品相关杂质含量低、中间体纯化容易，收率高。所制备的脂 肪二酸衍生物可以通过蛋白修饰通用技术用于长效胰岛素药物如德谷胰岛素的研发
[0008] 本发明的另一目的在于提供所述制备脂肪二酸衍生物的方法的应用。
[0009] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种制备脂肪二酸衍生物的方法，包括如 下步骤：
[0010] (1)将如式A所示的长链脂肪二酸和二氯亚砜反应，得到如式B所示的带有两个氯 基团的酰氯；接着将酰氯与叔丁醇反应，得到如式C所示的带有一个氯基团的酯；接着用羟 基取代氯基团，得到如式D所示的长链脂肪二酸一叔丁酯；其中，下述反应方程式中的m为 6~32的整数，优选为6~9 ;
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[0012] (2)将长链脂肪二酸一叔丁酯和N-羟基琥珀酰亚胺反应，得到如式E所示的长链 脂肪二酸琥珀酰亚胺基叔丁基酯；
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[0014] (3)将长链脂肪二酸琥珀酰亚胺基叔丁基酯与L-谷氨酸-1-叔丁酯反应，得到如 式F所示的叔丁基长链脂肪二酰基-L-Glu-OtBu;
[0016] (4)将叔丁基长链脂肪二酰基-L-Glu-OtBu与N-羟基琥珀酰亚胺反应，得到如式 G所示的叔丁基长链脂肪二酰基-L-Glu(OSu)-OtBu;
[0018] (5)将叔丁基长链脂肪二酰基-L-Glu(OSu)-OtBu中的叔丁基去除，得到如式H所 示的长链脂肪二酸衍生物。
[0019]
[0020] 步骤（1)中所述的二氯亚砜的用量为过量，即二氯亚砜和长链脂肪二酸的摩尔比 大于2;优选为6~23. 6:1。
[0021] 步骤（1)中所述的叔丁醇的用量按叔丁醇与长链脂肪二酸摩尔比为0. 6~1. 5 : 1 ;优选为1~1. 2 :1计算；更优选为按I. 1 :1计算。
[0022] 步骤（1)中所述的用羟基取代氯基团是通过将所述的带有一个氯基团的酯与溶 剂A水溶液中的水反应；溶剂A为N，N-二甲基甲酰胺（DMF)、乙腈、丙酮和四氢呋喃中一种 或至少两种，优选为N，N-二甲基甲酰胺。
[0023] 所述的溶剂A水溶液中溶剂A与水的体积比为I: 1~5,优选为1 :2~3,更优选 为 1 :2〇
[0024] 步骤（2)中所述的N-羟基琥珀酰亚胺的用量按其与所述的长链脂肪二酸一叔丁 酯摩尔比为1~1. 2 :1计算，优选为按1. 05 :1计算。
[0025] 步骤（3)中所述的L-谷氨酸-1-叔丁酯的用量按其与所述的长链脂肪二酸琥珀 酰亚胺基叔丁基酯摩尔比为1~1. 5 :1计算，优选为按1~1. 2 :1计算，更优选为按I. 1 : 1计算。
[0026] 步骤（4)中所述的N-羟基琥珀酰亚胺的用量按其与所述的叔丁基长链脂肪二酰 基-L-Glu-OtBu摩尔比为1~1. 2 :1计算，优选为按I. 1 :1计算。
[0027] 步骤（5)中所述的将叔丁基长链脂肪二酰基-L-Glu(OSu)-OtBu中的叔丁基去除 是通过将所述的叔丁基长链脂肪二酰基-L-Glu(OSu)-OtBu与三氟乙酸反应。
[0028] 所述的三氟乙酸的用量按其与所述的叔丁基长链脂肪二酰基-L-Glu(OSu)-OtBu 体积质量比为3~IOmL :Ig计算；优选为按3~5mL :Ig计算；更优选为按5mL :Ig计 算。
[0029] 为了降低整个反应过程的杂质，增加产物的得率和提高产物的纯度，在每得到一 个产物时，将未参与反应的物质去除。
[0030] 从而，所述的制备脂肪二酸衍生物的方法，优选包括如下步骤：
[0031] 1)将长链脂肪二酸和二氯亚砜反应制备得到酰氯，二氯亚砜的用量为过量，减压 蒸馏除去未参与反应的二氯亚砜，加入二氯甲烷溶解酰氯；将有机碱滴加入酰氯和叔丁醇 的混合物，反应生成带有一个氯基团的酯，减压蒸馏除去溶剂后，加入预冷至〇~4°C的溶 剂A水溶液，过滤收集沉淀；将沉淀中的溶剂去除，再往沉淀中加入溶剂B提取，蒸干溶剂后 重结晶，得到长链脂肪二酸一叔丁酯；
[0032]2)将长链脂肪二酸一叔丁酯溶解于溶剂C中，降温至-20°C~-KTC，加入N-羟基 琥珀酰亚胺（HOSu)和二环己基碳二亚胺（DCC)，-20°C~-10°C下继续反应2小时，恢复至 15~30°C继续反应3~16小时，过滤除去沉淀，减压蒸馏除去溶剂，重结晶，用溶剂D洗滤 饼，得到长链脂肪二酸琥珀酰亚胺基叔丁基酯；
[0033] 3)将长链脂肪二酸琥珀酰亚胺基叔丁基酯与L-谷氨酸-1-叔丁酯溶解在N，N-二 甲基甲酰胺中，在有机碱存在的条件下过夜搅拌，减压蒸馏除去溶剂，残留物溶于乙酸乙 酯，并依次用盐酸溶液、水和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥过滤，将滤液减压蒸馏， 得到的油状残余物，为叔丁基长链脂肪二酰基-L-Glu-OtBu;
[0034] 4)将叔丁基长链脂肪二酰基-L-Glu-OtBu溶解于溶剂E中，降温 至-20 °C~-10 °C，加入N-羟基琥珀酰亚胺（HOSu)和环己基碳二亚胺（DCC)， 于-20°C~-KTC下继续反应2小时，恢复至15~30°C反应3~16小时，过滤除去沉淀，减 压蒸馏除去溶剂，向残留油状物中直接加入溶剂F析出固体，过滤收集沉淀，得到叔丁基长 链脂肪二酰基-L-Glu(OSu)-OtBu;
[0035] 5)将叔丁基长链脂肪二酰基-L-Glu(OSu)-OtBu溶解于三氟乙酸中，15~30°C搅 拌反应，向反应液中加入溶剂G直接析出固体，抽滤收集固体，得到长链脂肪二酸衍生物。
[0036] 上述反应中所用的溶剂A-G是用于溶解或提纯用的，其用量和使用次数是不限 的。但从成本和达到的效果考虑，在下面分别限定了溶剂A-G的用量。
[0037] 步骤1)中所述的将长链脂肪二酸和二氯亚砜反应制备得到酰氯的条件为80°C加 热回流3小时或在DMF催化下于15~30°C反应过夜。
[0038] 所述的在DMF催化下于15~30°C反应过夜的操作优选如下：将长链脂肪二酸重 悬于二氯甲烷中，接着加入DMF和二氯亚砜，于15~30°C反应过夜。
[0039] 步骤1)中所述的有机碱为一乙胺、二乙胺、三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶和哌啶中 的一种或至少两种；优选为吡啶。
[0040] 步骤1)中所述的有机碱的摩尔用量相当于所述的长链脂肪二酸摩尔量的0. 6~ 1. 5倍；优选为L0~L2倍；更优选为L04~L05倍。
[0041] 步骤1)中所述的有机碱的加入时间控制在2小时以内，否则反应过程中会出现较 多杂质，给后续纯化带来困难。
[0042]步骤1)中所述将有机碱滴加入酰氯和叔丁醇的混合物的操作条件如下：反应温 度为20~30°C，优选20~25°C;反应时间为2~16小时，优选2