一种高得率高岩藻糖比例的岩藻多糖的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高得率高岩藻糖比例的岩藻多糖的提取方法，属于海藻加工利用
技术领域。
【背景技术】
[0002] 我国藻类资源丰富，尤以褐藻资源突出，是海藻生产和消费大国。褐藻中含有丰富 的多糖成分，如褐藻胶，海带多糖，卡拉胶等，均已成为重要的食品或医药原料并被广泛应 用。在我国、日本冲绳、沿海均有分布。
[0003] 岩藻多糖（Fucoidan)，是褐藻中所固有的细胞间多糖，存在于细胞壁基质中。近 代研究表明，岩藻多糖具有抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、促进肌肤再生、皮肤保湿等超 过20项的生理功效，低分子量岩藻多糖尤其以抗肿瘤功效最为突出。与灵芝多糖、姜黄素 等相比，岩藻多糖不仅能够增强人体免疫力，而且具有诱导肿瘤细胞凋亡的特殊功效，在功 能性食品和药品行业具有很大的发展潜力。
[0004]岩藻多糖主要成分是L-岩藻糖，线性主链一般是岩藻糖以a_l，3或a_l，4糖苷 键连接而成同时伴有半乳糖，甘露糖，葡萄糖，木糖等单糖组分的硫酸化杂多糖。吴兴中等 研究发现岩藻糖链在肝癌细胞迀移中可起到抑制作用，外源性的加入岩藻糖糖链时，癌细 胞迀移抑制呈浓度依赖性，由此可知，该多糖中岩藻糖的含量与岩藻多糖的生物学活性具 有相关联系。一般以褐藻为来源的岩藻多糖的岩藻糖含量在10-50%。硫酸多糖中硫酸根 的含量是决定其活性大小的极为重要的指标，同时也是研究构效关系的重要方面。对来源 于褐藻的天然硫酸多糖岩藻多糖，硫酸根的存在对其物理化学性质及生物活性同样具有重 要影响，因此硫酸根的含量是鉴定岩藻多糖样品及分析构效关系的重要参数。岩藻多糖的 传统提取方法中以水提法和酸提法最为常见，然而米取传统的提取发法所得的岩澡多糖杂 质多，得率低，品质低。当今市场所出售的岩藻多糖品质不高，含有部分褐藻胶成分，质量不 足以用于保健品行业，故寻求"高附加值，高效率，低成本"的海藻加工技术已成为新的发展 方向。由于原岩藻多糖分子质量大、溶解性差，不容易被吸收，严重限制了其应用，但经过部 分降解的低分子质量岩藻多糖，生物活性更加显著，研究表明，分子量8000-30000的岩藻 多糖抗肿瘤活性较高。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述问题，本发明提供了一种高得率高岩藻糖比例的岩藻多糖的提取方 法，是从海蕴中制备抗肿瘤岩藻多糖的的方法，该方法可高效制备出环保、无污染、高纯度 的岩藻多糖产品。
[0006] 本发明的目的是提供一种高得率高岩藻糖比例的岩藻多糖的提取方法，所述方法 包括：以海蕴为原料，经高压均质、离心取上清、乙醇沉糖、过滤、干燥，得岩藻多糖。
[0007] 所述高压均质，在本发明的一种实施方式中，是在10_20Mpa下，按料水比 1:30-1:160,均质1-3次。
[0008] 所述料水比，在本发明是指海蕴的干重与水的质量比。
[0009] 所述海蕴，在本发明的一种实施方式中，是干海蕴（湿度可以是8-10%)或者新鲜 海蕴。当使用干海蕴作为原料时，先加水泡一泡，吸水溶胀后再进行高压均质。
[0010] 所述乙醇沉糖，在本发明的一种实施方式中，是使用体积分数为70-80 %的乙醇。
[0011] 所述乙醇沉糖，在本发明的一种实施方式中，是取离心后的上清液，即提取液，加 入3-4倍体积的无水乙醇，混匀、静置，得沉淀物。
[0012] 所述离心，在本发明的一种实施方式中，是在4000-5000rpm下离心10-15min。
[0013] 所述过滤，在本发明的一种实施方案中，是采用离心或者板框过滤。
[0014] 所述干燥，在本发明的一种实施方案中，为真空干燥。
[0015] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，离心取上清与乙醇沉糖步骤之间，还包括 化学降解或者酶法降解、超滤，以获得相应分子量范围的岩藻多糖。
[0016] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，包括：（1)高压均质：取海蕴，按料水比 1:30-1:160加入水，然后在10-20Mpa下均质1-3次；(2)离心取上清：将高压均质后的物 料进行离心，取上清液，即为提取液；（3)化学降解：浓缩提取液至原体积的1/4-1/2,然后 加入30%的H2O2,，50-60°C水浴，降解l_4h，调节降解液pH至中性，然后加过氧化氢酶反应 10-20min;(4)超滤：降解液流经不同截留分子量的超滤柱，得截留液；(5)乙醇沉糖：在上 一步得到的截留液中加入3-4倍体积的无水乙醇，混匀，静置；(6)沉淀物经过滤、干燥，即 得岩藻多糖。
[0017] 所述步骤（3)，在本发明的一种实施方式中，30%H2O2的添加量为每L中添加 5_8mL〇
[0018]所述步骤（3)，在本发明的一种实施方式中，过氧化氢酶酶活为1万-5万U/mL，添 加量 0. 1-0. 4mL/L。
[0019]所述步骤（3)，在本发明的一种实施方式中，是采用截留分子量为30KD、IOKD的超 滤柱，从而得到分子量在10000-30000之间的岩藻多糖。
[0020] 所述步骤（3)，在本发明的一种实施方式中，是采用减压浓缩，条件为温度 70-75°C，真空度为-0?IMPa。
[0021] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，包括：（1)高压均质：取海蕴，按料水比 1:30-1:160加入水，然后在10-20Mpa下均质1-3次；（2)离心取上清：将高压均质后的物料 进行离心，取上清液，即为提取液；（3)酶法降解：浓缩提取液，加柠檬酸-柠檬酸钠调pH至 5-6,按照每L浓缩提取液添加50-55U的岩藻多糖酶，降解2-5h，降解液过超滤柱，得截留 液；（5)乙醇沉糖：在上一步得到的截留液中加3-4倍体积的无水乙醇，混勾，静置；(6)沉 淀物经过滤、干燥，即得岩藻多糖。
[0022] 所述岩藻多糖酶，在本发明的一种实施方式中，提取自黑曲霉。
[0023]所述岩藻多糖酶，在本发明的一种实施方式中，是通过以下方式得到的：将黑曲霉 进行液体发酵培养，发酵液离心后的上清液为粗酶液1，菌体经复溶、超声破碎、冷冻离心 后的上清为粗酶液2 ;取粗酶液，4°C加入硫酸铵固体至饱和度为80 %，搅拌2h，静置过夜， 10000rpm/min，冷冻离心 20min，收集沉淀，T-buffer溶解，10000rpm/min，冷冻离心 20min 后取上清，并在4°C下透析24h，浓缩，过DEAE-sepharoseFF阴离子交换柱，T-buffer平衡， 用0-2MNaCl梯度洗脱，收集洗脱峰，合并组分，浓缩，在4°C下透析24h，浓缩，过凝胶色谱 柱sphacryl S-300,磷酸缓冲液平衡，洗脱收集活性组分，浓缩，冻干得纯酶。
[0024] 所述岩藻多糖酶，在本发明的一种实施方式中，其酶活测定方法为：将待测酶液加 到〇.5%岩藻多糖溶液（用缓冲液配制），在50°(：，反应111。沸水浴灭酶15 1^11，用0吧法 测定还原糖含量，空白为将待测酶液于沸水浴15min后，再进行上述操作；酶活单位定义为 50°C、pH值6. 0条件下每小时释放Iymol岩藻糖需要的酶量。
[0025] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，高压均质步骤后紧接水提步骤；所述水提 是在超声或者搅拌条件下进行。
[0026] 所述水提，在本发明的一种实施方式中，是将高压均质后的物料，在超声或者搅拌 条件下提取l_6h，然后再进行下一步的离心操作。
[0027] 所述水提，在本发明的一种实施方式中，是在50_60°C水浴下进行。
[0028] 所述水提，在本发明的一种实施方式中，是反复提取2-3次，提取液合并。
[0029] 本发明所具有的优点：
[0030] 1.本发明采用海蕴为原材料，采用高压匀浆的方法提取岩藻多糖，提取时间短，提 取效率高，而且最大程度的保留了岩藻多糖天然组分的含量。
[0031] 2.本发明利用高压匀浆，与化学降解法或酶法降解法相结合降解岩藻多糖，通过 超滤技术，最终获得抗肿瘤活性明显的中低分子量的岩藻多糖。
[0032] 3.本发明提取条件温和，不用酸碱类，最大限度的保证了岩藻多糖的生物活性，而 且提取过程中无酸碱类废液的排放，有利于环保。
[0033] 4.本发明制得的岩藻多糖的得率在21%-35%，纯度85%-90%，其中岩藻糖含量 达70 % -75 %，有机硫酸跟含量达20 % -23 %，分子量10000-30000，达到市场一级以及优级 品标准。
【具体实施方式】
[0034] 岩藻多糖测定：采用苯酚硫酸法测多糖，以岩藻糖标准做标准曲线；以岩藻糖浓 度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线方程y= 0. 0135x+0. 0066,R2= 0.9991。
[0035]岩藻多糖的单糖组分分析：离子色谱-脉冲安培法（IC-PAD)，色谱柱为CarboPac PA20 ;流动相：H20,250mmol/LNa0H，lmol/L NaAc ;流速：0.