一种猪体细胞核移植融合方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及克隆技术领域，具体设及一种猪体细胞核移植融合方法。
【背景技术】
[0002] 1997年克隆羊--"Dolly"出生，开启了动物体细胞核移植技术的新篇章。随后多 种哺乳动物如牛、小鼠、山羊、猪、兔等被相继克隆成功。体细胞核移植技术即克隆技术，通 常是通过显微操作的方法将受体卵母细胞的细胞核去除，然后将供体细胞注入到已去核的 卵母细胞内，形成一个新的重构胚，再通过融合技术将重构胚的供体细胞核导入到去核卵 母细胞胞质中，使移入的核在受体胞质的作用下激活发生发育程序重编，使得重构胚能与 正常受精胚一样细胞分裂、分化，经过手术移植到代孕母体内发育成一个新的个体，其获得 的个体与亲本具有相同遗传性状。从第一例克隆猪的nishi，2002)诞生至今已有13年，但 是整体效率依然没有突破只有1% -2%。如何提高整体的克隆效率，许多实验室进行了大 量的研究，包括提高卵母细胞质量、融合激活方法与参数研究、供体细胞处理、胚胎处理、移 植方法等。
[0003] 将供体细胞的细胞核导入到卵母细胞质中，运个过程称之为融合。如果没有细胞 融合技术，著名的克隆羊一"Dolly"可能就无法诞生。最早使用的融合技术是使用灭活的 仙台病毒（HVJ) (McGrath and Solter，1983)介导细胞融合，获得了成功，但是效果很不稳 定而且毒性大。Willadsen等（1986)在利用胚胎细胞克隆羊试验中采用的是直流电介导 融合的方法，简便而且高效，电融合技术也是从运个时候开始发展起来的，其原理是通过电 流的刺激使紧密接触的细胞膜憐脂双分子层发生结构改变，进而形成细胞间的孔道，随着 孔道逐渐扩大使胞质交融在一起。克隆羊"Dolly"就是运用电融合技术，目前已经成为动 物克隆中普遍采用的融合方法。若融合率越高，操作速度越快，单位时间生产的胚胎数就越 多，体细胞核移植效率也就相应的提高了。
[0004] 然而，由于技术操作上的差异、融合激活参数、供体细胞类型和操作人员熟练程度 等因素导致融合率不稳定，是影响克隆效率的因素之一。由于是在体视显微镜下直接操作， 受到视野范围大小的影响，在保证可W看见体细胞的情况下尽可能多操作一些。在实际操 作过程中普遍的操作是：将一批重构胚5~10个成一条直线放入融合槽内后（图1)，使供 体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行后即施加直流电脉冲诱导融合。一次性操作数量 较少，会影响到整体的融合速度。特别对于猪而言，每次需要移植300左右的重构胚，才能 有效维持猪的妊娠。一次性操作运么多胚胎，体外融合速度就成了很重要的影响因素。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有猪体细胞核移植融合操作过程中， 一次性操作数量少，整体融合速度慢的缺点，提供一种猪体细胞核移植融合方法。
[0006] 本发明所要解决的上述技术问题，通过W下技术方案予W实现：
[0007] 一种猪体细胞核移植融合方法，包含如下步骤：
[0008] SI.将构建好的重构胚放入融合液中平衡，然后用融合液洗涂，再放入铺满融合液 的融合槽中；
[0009] S2.拨动重构胚，使供体细胞与受体卵细胞膜接触面与电极平行放置，同时使重构 胚在融合槽中成非直线排列；
[0010] S3.用细胞融合仪施加直流电脉冲诱导融合并同时激活，
[0011] S4.接着用胚胎培养液洗涂，然后置于培养箱中培养，再在体视显微镜下判定融合 情况。
[0012] 本发明的方法在进行融合操作时，使供体细胞与受体卵细胞膜接触面与电极平行 同时使重构胚在融合槽中成曲线排列（图2)，然后施加直流电脉冲诱导融合，在同样的视 野下可W增加一次性操作的数量，提高整体融合速度而不会影响克隆胚胎的后期发育。 阳01；3] 优选地，S1.所述的融合液的含有0. 25mol/L甘露醇（MannitoD、0.1 mmol/L 化(：12'2&0、0.1111111〇1/11邑(：12.6&0、0.5111111〇1/14-径乙基赃嗦乙横酸化6阳巧、0.01%聚 乙締醇（PVA) (w/v)。
[0014] 优选地，S1.中平衡所用的时间为1~5min，用融合液洗涂的次数为2~5次。
[0015] 优选地，S2.所述的非直线排列为曲线排列。
[0016] 优选地，S3.中所述的细胞融合仪的型号为化S-150B融合仪。
[0017] 优选地，S3.中所述的直流电脉冲80-100v/mm，80-100 y S，脉冲次数为2~3次。
[0018] 优选地，S4.中所述的胚胎培养液为PZM-3培养液。
[0019] 优选地，S4.中置于培养箱中培养的条件为39°C，5% C02,饱和湿度，培养地。
[0020] 有益效果：（1)本发明克服了现有猪体细胞核移植操融合操作过程中，一次性操 作数量少，整体融合速度慢的缺点，提供了一种新的猪体细胞核移植融合方法；（2)本发明 所述的猪体细胞核移植融合方法一次性可W操作融合15~20个重构胚，相对于现有技术 一次性只能操作5~10个重构胚而言，大幅度提升了融合效率。
【附图说明】
[0021] 图1为重构胚呈直线排列的猪体细胞核移植融合方法图。
[0022] 图2为重构胚呈曲线排列的猪体细胞核移植融合方法图。
【具体实施方式】
[0023] W下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限 定。
[0024] 实验研究所用试剂未经特殊说明均购自SIGMA公司。胎牛血清（GIBC0)，生理盐 水（紫光古汉集团衡阳制药有限公司）；细胞培养相关耗材为Corning公司产品；卵母细 胞成熟及细胞、胚胎培养耗材为NUNC公司产品。洗卵液为DPBS+PVA液，操作液为无巧的 H-NCSU-23，卵母细胞成熟培养液为添加体积分数10%猪卵泡液的TCM-199液，胚胎培养液 为PZM-3。按照常规的体细胞核移植技术构建克隆胚胎。 阳〇2引实施例1
[0026] 1、卵母细胞收集及体外成熟培养
[0027] 猪卵巢采至广州天河屠宰场，用剪刀去除输卵管等组织后将卵巢置于含抗生素的 37 °C生理盐水中，用保溫瓶化内运回实验室。用含抗生素