一种增强外源基因表达的方法
【专利说明】-种增强外源基因表达的方法 (-)技术领域
[0001] 本发明设及一种增强外源基因表达的方法。 (二）【背景技术】
[0002] 生物技术是一种有效改良植物性状的方法。在目标基因表达框中加入增强子序列 是确保外源基因在转基因植物中高水平表达的有效方法。在现代基因工程育种中，经常需 要同时将多个不同的基因转入到同一植物受体中，因此T-DNA往往同时含有多个基因的表 达框。研究显示，T-DNA的长度与农杆菌转化效率成负相关，T-DNA越长，转化效率越低。同 时，T-DNA序列越长，基因操作的难度也越大。因此在T-DNA设计中，如何有效利用基因增 强子序列，在不大幅度加长T-DNA的情况下提高外源基因的表达水平具有重要的意义。 (H)
【发明内容】
[0003] 本发明目的是提供一种能同时提高T-DNA中多个基因表达强度的基因增强子序 列，W及通过在T-DNA中加入一段增强子调控序列，提高调控序列两侧目的基因的转录水 平，从而提高目的基因的表达量。
[0004] 本发明采用的技术方案是：
[0005] 本发明提供一种增强外源基因表达的方法，所述方法为：将基因增强子连接在两 条目的基因表达框之间，所述基因增强子的核巧酸序列为SEQ ID N0.1所示。优选所述目 的基因为抗虫基因和抗草甘麟基因。
[0006] 进一步，所述基因增强子连接在抗虫基因表达框3'端和抗草甘麟基因表达框5' 端之间。
[0007] 进一步，所述基因增强子连接在抗虫基因表达框5'端和抗草甘麟基因表达框5' 端之间。
[0008] 进一步，所述基因增强子连接在抗虫基因表达框5'端和抗草甘麟基因表达框3' 端之间。
[0009] 进一步，所述抗虫基因表达框的核巧酸序列为SEQ ID NO. 2所示，表达框中 l-2025bp为玉米polyubiquitin-1基因启动子，表达框中的2026-5886bp为抗虫融合基因， 编码的氨基酸序列为沈Q ID N0:3,表达框中5887-6093bp为玉米阳P carbo巧lase基因 终止子。
[0010] 进一步，所述抗草甘麟基因表达框的核巧酸序列为SEQ ID NO. 4所示，表达框中 l-2020bp为玉米polyubiquitin-1基因启动子，表达框中2021-3535bp为连接有AHAS信号 肤的抗草甘麟基因，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO :5,表达框中3536-3732bp为花挪菜花 斑病病毒（Cauliflower Mosaic Virus, CaMV)的 35S 终止子。
[0011] 在植物中，基因增强子能够有效增强序列5'和3'端两侧外源基因表达框中的目 的基因的转录水平，从而提高外源基因表达量。所述外源基因的表达是通过将外源基因连 接到T-DNA载体中，然后将载体转入宿主内来实现。所述方法是将基因增强子连接在两条 目的基因表达框之间，然后构建T-DNA载体，具体所述T-DNA中各元件的排列顺序为T-DNA 右臂序列、抗虫表达框、基因增强子、抗草甘麟表达框和T-DNA左臂序列，其中基因增强子 可W是位于抗虫基因表达框3'端和抗草甘麟基因表达框5'端之间（如图1中A所示）， 调控基因也可W是位于抗虫基因表达框5'端和抗草甘麟基因表达框5'端之间（如图1中 B所示），或者是调控基因位于抗虫基因表达框5'端和抗草甘麟基因表达框3'端之间（如 图1中C所不）。
[0012]与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种可W大幅度提 高基因增强子5'和3'端两翼基因的转录水平，从而增强外源基因的表达量，同时提高抗虫 和抗草甘麟基因的表达，获得抗虫和抗草甘麟同时高表达的转基因植物。 (四）
【附图说明】
[001引 图1为玉米转化载体构建示意图，LB和RB :T-DNA的边界序列；UBQ :玉 米polyubiqutin-1启动子；EN :增强调控序列；GlOevo :抗草甘麟EPSPS基因； CrylAb-Cry2Aj :抗虫化融合基因crylAb-c;ry2Aj，Pepc ter:玉米阳PC基因终止子，35S ter:花挪菜花斑病病毒（Cauliflower Mosaic Virus, CaMV)35S终止子，A、B、C为增强调 控序列元件不同排列顺序。
[0014] 图2为玉米转化对照载体构建示意图，LB和RB :T-DNA的边界序列；UBQ :玉 米polyubiqutin-1启动子；GlOevo :抗草甘麟EPSPS基因；CrylAb-Cry2Aj :抗虫化融 合基因crylAb-c巧2Aj，化pc ter:玉米阳PC基因终止子，35S ter:花挪菜花斑病病毒 (Cauliflower Mosaic Virus, CaMV)35S终止子，A、B、C为玉米转化对照载体元件不同排列 顺序。 (五）
【具体实施方式】
[0015] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0016] 本发明W下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在 Ausubel 编写，由 John Wiley and Sons 公司出版的化rrent Protocols in Molecular Biology 和 J.Sambrook 等编写，由 Cold Spring Harbor L油oratory Press (2001)出版的 Molecular Cloning :A L油ortoiT Manual,化d ED.等文献均有详细的说明。
[0017] 实施例1玉米转化载体构建
[0018] 抗虫表达框构建，利用常规分子生物学技术将来源于玉米的化lyubiqutin-1启 动子，抗虫融合基因和玉米的PEP carbo巧lase基因（P巧C)终止子连接形成抗虫表达框， 核巧酸序列为SEQ ID NO :2。
[0019] 抗草甘麟表达框构建，将来源于玉米的化lyubiqutin-1启动子，5'端连有一段编 码AHAS基因叶绿体信号肤的抗草甘麟基因和玉米的阳P carbo巧lase基因（P巧C)终止子 连接形成抗草甘麟表达框，其核巧酸序列为SEQ ID NO :4。
[0020] W Cambial300(Cambia，AU，载体序列在 NCBI 中编号为 AF234296. 1)载体为框架， 经化〇1和化nl双酶切，去除载体T-DNA中的基因部分，将抗虫表达框、增强调控序列（即 基因增强子，核巧酸序列为SEQ ID N0:1)和抗草甘麟表达框根据图1中A的排列顺序和方 向连接得到植物转化载体PI。
[0021] W Cambial300载体为框架，经化〇1和化nl双酶切，去除载体T-DNA中的基因部 分，将抗虫表达框和抗草甘麟表达框根据图2中A的排列顺序和方向连接得到植物转化载 体PICK。
[0022] W Cambial300载体为框架，经化〇1和化nl双酶切，去除载体T-DNA中的基因部 分，将抗虫表达框、增强调控序列（核巧酸序列为SEQ ID NO :1)和抗草甘麟表达框根据图 1中B的排列顺序和方向连接得到植物转化载体P2。
[0023] W Cambial300载体为框架，经化〇1和化nl双酶切，去除载体T-DNA中的基因部 分，将抗虫表达框和抗草甘麟表达框根据图2中B的排列顺序和方向连接得到植物转化载 体P2CK。
[0024] W Cambial300载体为框架，经化〇1和化nl双酶化去除载体T-DNA中的基因部 分，将抗虫表达框、增强调控序列（核巧酸序列为SEQ ID NO :1)和抗草甘麟表达框根据图 1中C的排列顺序和方向连接得到植物转化载体P3。
[00巧]W Cambial300载体为框架，经化〇1和化nl双酶切，去除载体T-DNA中的基因部 分，将抗虫表达框和抗草甘麟表达框根据图