一种微生物智能梯级耐热调控方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及利用构建的微生物智能梯级耐热调控方法提高大肠杆菌的耐热性及其工业应用，属于生物化工领域。
【背景技术】
[0002]在过去的30多年中，微生物转化技术在有机化学合成领域中的尝试不仅使理论研究获得广泛开展，在实际应用方面也取得了长足的进步。许多化学合成工艺相当复杂的药物、食品添加剂、维生素、化妆品和其它一些精细化工产品能够用微生物转化技术获得。尽管有诸多的引用，微生物转化也面临着一系列潜在的未解决的问题。其中一个严重的问题是微生物在生长与生产过程中经常遭受逆境环境的影响，例如，强酸，强碱，高温，有机溶剂，搞渗透压等。尤其是高温胁迫对工业生产影响严重。
[0003]工业微生物发酵过程中，由于发酵罐体积较大，生物代谢热和机械搅拌热致使发酵体系不断升温。常用工业微生物的最适生长范围为25°C _37°C，微生物无法自行降到最适生长温度，所以需要消耗大量冷却水控温，导致能耗的增加，约占到发酵过程总成本的25% -40%左右。如果能提高发酵菌株的耐热性，将会为工业生产带来大量优势:1)减少冷却成本，大幅度降低成本；2)由于平衡了微生物的生长温度与酶最适催化温度之间的障碍，加速代谢，提高细胞合成效率，可提高生产效率，缩短发酵周期；3)从化学反应热力学角度分析，提高温度可以有效地活化反应过程，加速传质过程，提高挥发性产品的分离提取；4)由于发酵温度的提高，也可减少染菌几率。
[0004]提高菌株的耐热性有高温驯化和分子改造等方法。但是传统的高温驯化及诱变方法不但周期长，工作量大，耗费人力物力，而且这种方法虽然能提高菌株最适生长温度，在原来的最适生长温度下不能很好的生长，而工业微生物发酵是一个不断升温的过程，需要在一个较宽泛的温度范围内都能较好的生长，所以菌株驯化无法满足工业发酵逐渐升温的需求。从分子层面上研究大肠杆菌耐热性目前国内外已有报道，为构建大肠杆菌耐热人工合成体系提供了可能性，但是目前研究主要通过改变大肠杆菌本身的转录因子或蛋白表达来改造大肠杆菌的耐热性，或者通过引入外源耐热机制来改造菌株耐热性，虽已有报道，但受限于菌株本身的生物系统的复杂性，单纯通过引入的单个基因或简单策略并不能彻底的改造微生物的耐热性。
[0005]嗜热微生物大部分属于古菌，一般生活在地球上的极热环境中，代表了生命温度的极限，从遗传水平、转录水平、翻译水平上甚至微生物群体水平上形成一套完整的耐热机制。微生物上万年的自然进化，给了我们足够的启发，供我们去学习模拟。
[0006]进入二十一世纪后，合成生物学蓬勃发展，将工程原理应用到生物学，旨在人工设计基因编码的生物系统，增加生物的系统性，可预见性，鲁棒性，可扩展性，高效性。因此，合成生物学为我们改造微生物的耐热性提供了高效强力的方法。
[0007]以构建耐热大肠杆菌底盘宿主为目的，本研究利用合成生物学方法创建的微生物智能梯级耐热调控方法，能在细胞和菌群两个层面上提高微生物的耐热性。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是为解决工业微生物培养过程中由于控制常温发酵导致生产过程高能耗的问题。提供一种微生物智能耐热梯级调控方法。其主要包括两个系统，耐热系统和数量调控系统。
[0009]微生物梯级耐热系统包括从嗜热微生物中筛选得到的热激蛋白(HSPs)、类泛素、泛素和转录因子等作为耐热功能元件，以人工设计的RNA温敏开关与启动子组合为调控元件。利用RNA温敏开关对不同温度响应开启最佳耐热功能元件的表达，实现微生物的梯级耐热，可成功地拓宽微生物的最适生长温度。
[0010]微生物数量调控系统则利用群体感应系统和RNA温敏开关组合为与门开关，动态地开启利他性程序死亡系统，有效地控制了系统的代谢热，从而在菌群层面上提高微生物适应热胁迫的能力。
[0011]通过两个系统的协同作用，提高了微生物对特定高温以及高温波动的适应性与鲁棒性。将该方法应用于工业生产中，一方面有利于发酵产业减少冷却系统的能耗，另一方面由于高温下能提高大部分酶的活性与细胞代谢，可以在一定程度上提高生产效率。
[0012]本发明的提高大肠杆菌耐热性的调控方法，具有以下优点:
[0013]1、本发明用RNA温敏开关调控耐热功能元件的表达，可以降低在正常生长温度下，过表达热激蛋白引起的代谢负担。
[0014]2、通过用对不同温度敏感的RNA温敏开关，调控不同功能的耐热功能元件，在大肠杆菌内实现了梯级耐热，利用温度的梯级调控使不同的蛋白高效发挥作用，成功拓宽大肠杆菌的最适生长温度。
[0015]3、通过RNA温敏开关和群体感应系统构建的与门开关可以同时响应温度与密度的变化，对细胞的数量进行动态调控，以适应环境温度的变化。
[0016]4、通过耐热系统与数量调控系统的协同作用，可以在细胞与群体两个水平上提高微生物的耐热性。
[0017]5、将该微生物智能耐热梯级调控方法应用于工业微生物的耐热性改造，不仅可以提高其在高温下的生长能力与生产能力，提高生产效率，还可以提高发酵温度，降低冷却成本。
【附图说明】
[0018]图1是本发明实验例证中具有梯级耐热系统的工程大肠杆菌耐热性验证；
图2是根据与门真值表对本发明实验例中具有群体数量调控系统的工程大肠杆菌功能验证。
图3是本发明实验例证中具有梯级耐热系统和数量调控系统的工程大肠杆菌耐热性验证；
图4是本发明实验例证中具有梯级耐热系统和数量调控系统的工程大肠杆菌的赖氨酸发酵应用
【具体实施方式】
[0019]下面以模式微生物大肠杆菌作为实施例，对本发明的【具体实施方式】进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0020]实施例1:人工RNA温敏开关的设计与构建
[0021]借鉴于天然的RNA温敏开关的基本结构，人工RNA温敏开关的结构主要由RBS序列(5’-AAGGAG-3’)，ARBS(ant1-RBS，反义RBS序列)以及之间的环状结构构成。RNA温敏开关的二级结构以及自由能可以通过The mfold Web Server预测和计算。可以通过改变茎环碱基序列匹配程度，G-C含量以及环状结构的大小，来调整RNA温敏开关自由能的大小，从而获得响应不同温度的RNA温敏开关。因此根据The mfold Web Server模拟得到的自由能，我们设计了一系列不同梯度自由能的RNA温敏开关。通过验证与筛选获得了一个响应不同温度的RNA温敏开关元件库。