大肠杆菌的易错全基因组改组方法及耐受丁醇的大肠杆菌的制作方法【
技术领域：
】[0001]本发明属于生物工程领域，涉及一种运用易错全基因组改组技术提高大肠杆菌的丁醇耐受性的方法及耐受丁醇大肠杆菌。【
背景技术：
】[0002]随着化石能源的日益枯竭，温室效应的逐步显现，清洁可替代的生物能源已成为全球的研究热点。大肠杆菌具有繁殖速度快、易进行基因修饰等优点，作为细胞工厂构建代谢途径生产化工产品已经备受瞩目[I]。但E.COli菌体对丁醇的耐受性不高，成为其作为工业化宿主菌株的一大缺陷。因此，有效的提高E.coli对丁醇的耐受性是其作为细胞工厂生产丁醇的必要条件[1-4]。[0003]目前通过丁醇耐受性相关基因的过表达、适应性进化等手段获得丁醇耐受性菌株。利用代谢工程提高菌株丁醇耐受性需要掌握详尽的遗传学知识，而很多菌种的代谢机制、转录调控机制等认知不全，使得基因工程、代谢工程技术在菌种改造中存在局限性[2-4]。运用分子生物学手段对某一或某几个特定基因过表达或敲除难以多方位改造菌的特性、大幅度提高其耐受性。目前大肠杆菌的丁醇耐受机制不清晰，也限制了运用系统生物学手段同时改变多基因表达以获得优化的耐受菌株。因此，随机突变获得的耐受丁醇菌是有效途径之一。[0004]全基因组改组技术能有效的获得多基因突变有特定性能的菌株。传统的全基因组改组技术需要结合理化诱变获得优良菌株进而通过原生质体融合而实现各菌株全基因的洗牌，从而筛选出耐受性状提高的菌[5]。理化诱变筛选菌的方法对操作人员有一定的危害、适应进化也费时费力。因而，本发明运用易错全基因改组手段获得具有耐受性的大肠杆菌，以提高其作为细胞工厂构建丁醇代谢菌的应用能力。[0005]参考文献:[0006]1.刘增然张光一.合成高级醇的微生物细胞工厂研究进展生物工程学报，2013，29(10):1421-1430.[0007]2.ETjZ.K.a.P.,GroESLoverexpress1nimpartsEscherichiacolitolerancetoi_，n_，and2_butanol，1，2，4—butanetr1landethanolwithcomplexandunpredictablepatterns.MetabolicEngineering,2013.15:196-205.[0008]3.AtsumiSjff.T.,MachadoJM，etal.,Evolut1n,genomicanalysis,andreconstruct1nofisobutanoltoleranceinEscherichiacol1.MolecularSystemsB1logy,2010:449.-452[0009]4.ReyesLHjA.M.,WinklerJ，etal.,Visualizingevolut1ninrealtimetodeterminethemolecularmechanismsofn-butanoltoleranceinEscherichiacol1.MetabolicEngineering,2012:579-590.[0010]5.罗剑，杨民和，施巧琴.微生物菌种选育中的基因组改组技术及其应用进展生物技术2008,81-83.【
发明内容】[0011]本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种大肠杆菌的易错全基因组改组方法。[0012]本发明的第二个目的是提供一种耐受丁醇的大肠杆菌。[0013]本发明的技术方案概述如下:[0014]大肠杆菌的易错全基因组改组方法，包括如下步骤:[0015](I)基因组DNA提取:提取出发菌株大肠杆菌BW25113的基因组DNA；[0016](2)易错PCR扩增全基因组:[0017]取5μL的dNTPS母液、16.6μL的100uM10-17个碱基的随机引物、3μL的15mM的MnCl2、5yL的1X突变buffer、20ng步骤(I)获得的基因组DNA、2.5μL的2U/μLTaqDNA聚合酶、补充无菌水至50μL;所述dNTPS母液含1mMdCTP和dTTP、2mMdATP和dGTP；所述1X突变buffer含ImMρΗ8.3的Tris-HCl，0.7mMMgCl2、5mMKC1、lg/100mL甘油；[0018]易错PCR反应条件:94°C预变性5分钟；92°Clmin，再在37°C的条件下退火lmin，再由37°C以每秒变化0.1°(:的速度升至55°(:，55°(:延伸4min，进行50个循环，55°C补充延伸1min；[0019](3)全基因组改组:将步骤⑵获得的PCR产物通过乙醇沉淀浓缩10倍，制备出发菌株大肠杆菌BW25113的感受态细胞；取浓缩后的PCR产物3_5μL至50ul所述大肠菌的感受态细胞，1800V电击后加入LB液体培养基，混匀后转移到无菌离心管中于37°C静置培养1-2小时，涂布于丁醇浓度为1-1.6%V/V的LB固体培养基筛选平板，倒置放于培养箱37°C培养1-3天，得丢失含有pKD46质粒的单克隆即转化子；[0020](4)评价:挑取步骤(3)所述单克隆至LB液体培养基中于静置培养至对数晚期，保存菌液；分别接种上述单克隆的菌液和出发菌株大肠杆菌至LB液体培养基，培养至0D6。。为1.2-1.8;再分别转接至丁醇浓度为0.8%V/V的LB液体培养基，使各个菌株的初始接种浓度一致，测定生长曲线，筛选出耐丁醇的转化子；[0021](5)第二轮全基因组改组，即转化子Bwl.3(2)-4的改组:将步骤(4)中获得的丁醇耐受性最强的转化子Bwl.3(2)-4进行第二轮的易错全基因改组；为提高外源易错PCR产物与基因组中的各个基因的重组效率，将含有Red重组酶基因的pKD46质粒从大肠杆菌BW25113菌中提取后重新转化到转化子Bwl.3(2)-4，获得含有pKD46质粒的BWl.3(2)-4的菌株，按照步骤⑴-⑶对含有口10)46质粒的811.3(2)-4的菌株进行全基因组改组，其中步骤(3)所述LB固体培养基筛选平板的丁醇浓度改为1.6-2.0%V/V，筛选得到单克隆即转化子；[0022](6)第二轮全基因改组后获得转化子的丁醇耐受评价:挑取步骤(5)所述单克隆、大肠杆菌BW25113、转化子BWl.3(2)-4分别接种至LB液体培养基，培养至对数晚期，再分别转接至丁醇浓度为0.85%V/V的含丁醇的LB液体培养基，使各个菌株的初始接种浓度一致，测定生长曲线，筛选出耐丁醇能力更强的转化子。[0023]耐受丁醇的大肠杆菌，其分类命名为大肠杆菌(Escherichiacoli)Bwl.8_4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNO:M2015365o[0024]本发明的方法获得的耐受丁醇的大肠杆菌，能在0.85%V/V丁醇的LB液体培养基中高效的生长。与传统的全基因组改组技术相比，本发明有效地运用易错PCR技术实现无需理化诱变和原生质体融合即能快速有效获得耐受丁醇的大肠杆菌。在丁醇浓度为0.85%V/V的培养基中出发菌株大肠杆菌BW25113的生长受到严重抑制，而本发明的方法获得的耐受丁醇的大肠杆菌比出发菌株耐受丁醇能力强。传统的易错PCR技术只能对特定的基因进行有效突变，而全基因组改组技术需要结合理化诱变获得优良菌株进而通过原生质体融合而实现各菌株全基因的洗牌，从而筛选出耐受性状提高的菌m。理化诱变筛选菌的方法给操作人员带来化学试剂和辐射的污染，本发明采用全基因组改组技术与传统的全基因改组技术比，无需原生质体融合和诱变、所使用的试剂安全环保，操作快捷高效。，本发明采用含有PKD46质粒的BW25113菌作为出发菌株，该质粒含有red重组酶基因能提高重组效率，将其运用到易错全基因组改组，能高效地获得耐丁醇的大肠杆菌，本发明的方法比适应性驯化的方法效率高，时间短。本发明采用两轮全基因改组提高大肠杆菌的丁醇的耐受性，第二轮改组时将含有red重组酶基因的pKD46质粒转入转化子中，本发明的方法也可以用于出发菌株不含PKD46质粒的大肠杆菌，即提取BW25113的pKD46质粒，转化至不含该质粒的其它大肠杆菌菌株，以提高重组效率。【附图说明】[0025]图1为大肠杆菌BW25113的易错PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，M为3μLTIANGEN公司MarkerIII，从上至下所指示的条带分别为4500bp、3000bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp和200bp。泳道I至9为实施例2中用12_17bp的随机引物获得的5μL的易错PCR产物的电泳图。[0026]图2为大肠杆菌BW25113和实施例3获得的单克隆在丁醇浓度为0.8%V/V的LB液体培养基中的生长发酵比较。[0027]图3M为3μIMa当前第1页1 2 3