一种高纯度井冈霉素a的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种尚品质井闪霉素A的新制备工艺。 (二）
【背景技术】
[0002] 井闪霉素是我国自主开发并生产的氨基糖苷类农用抗生素，由吸水链霉菌井冈变 种（Streptomyceshygroscopicusvar.jinggangensisyen)代谢产生，能有效抑制水稻纹 枯病菌，现已成为我国产量最大、发酵单位最高的抗生素之一，是生物农药的最主要品种之 O
[0003] 井冈霉素是种多元混合物，主要由井冈霉素A、B、C、D、E、F、G和H(如表1所示） 等组分组成，其中A组分对水稻纹枯病的活性最强、含量最高，C和D组分几乎无效，还有井 冈羟胺A、B和G，它们是不含葡萄基的二环环醇类物质。
[0004] 目前，井闪霉素的产品有水剂和粉剂两种剂型。水剂的生产工艺为发酵液经预处 理再过滤，通过浓缩而得，含有较多的糖分、蛋白质等培养基残留成分。粉剂的生产工艺依 据井闪霉素是弱碱性抗生素，其分子结构中亚胺部分带弱性正电荷的特点，利用离子交换 法与膜分离法相结合提取工艺路线，可以制备含井闪霉素A60万（60%)以上粉剂。该工 艺路线已应用于生产，大部分产品出口，已获得较高的经济效益。
[0005] 井冈羟胺或井冈霉素的化学结构如下，井冈霉素不同组分的化学结构见表1 :
[0006]
[0007] 但是随着产品出口数量的增加，国外用户对井冈霉素的质量要求也越来越高，已 不满足于现有的井闪霉素A60万含量，且因发酵原因，有的发酵批次最终产品中井闪霉素 A还达不到60%，从而影响出口。另一方面，在井闪霉素粉剂中含有大量的井闪羟胺A，有的 批次高达30%。如果能把井闪羟胺A生物转化成井闪霉素A，制备高井闪霉素A产品，对井 冈霉素产品出口创汇和企业发展都具有重要的经济意义。
[0008] 表1 :井闪霉素不同组分的化学结构
[0009]
(三）
【发明内容】
[0010] 本发明提供一种尚品质井闪霉素A的新制备工艺。
[0011] 本发明采取的技术方案是：
[0012] -种井闪霉素A的制备方法，其特征在于，所述方法为先将井闪羟胺A吸附在阳 离子树脂上，以大肠杆菌湿菌体作为糖基转移酶催化剂，在水中加入纤维二糖，使其在水 中终浓度为0.05~1.5%g/ml，在反应温度为25~35°C，pH为5.0~7.0的条件下反应 12~48h;反应结束后，过滤取滤饼用0. 2~I. 2mol/L氨水溶液洗脱，经HPLC跟踪检测收 集井闪霉素A组分，浓缩后进行喷雾干燥或冷冻干燥，制备获得井闪霉素A，所述的井冈羟 胺A与纤维二糖的质量比为I:1. 5~2. 5。反应式如下：
[0013]
[0014] 糖基转移酶催化制备井闪霉素A
[0015] 本发明推荐所述的将井闪羟胺A以井闪羟胺水溶液的形式吸附在阳离子树脂上， 并按如下步骤操作：在阳离子交换凝胶树脂中加入含井闪羟胺A的水溶液，充分搅拌，使井 冈羟胺A吸附完全，所述的阳离子交换凝胶树脂与井闪羟胺A水溶液的体积比为1 :0. 8~ 1. 5所述的井冈羟胺A水溶液的浓度为0. 3~0. 8 %g/mL。
[0016] 进一步，所述的大肠杆菌湿菌体的用量以井冈羟胺A质量计为0. 5~2.Og/g。
[0017] 再进一步，所述的浓缩是在<50°C下真空浓缩，再干燥获得产品。更优选所述的浓 缩通常在5~50°C温度-0. 95~-1个大气压的真空条件下进行。
[0018] 优选的，阳离子树脂可选择强酸型阳离子交换凝胶树脂、弱酸型阳离子交换凝胶 树脂、强酸型阳离子交换大孔树脂、弱酸型阳离子交换大孔树脂。更优选选择强酸型阳 离子交换凝胶树脂，具体的，所述阳离子树脂为下列之一 ：001X7、001X4、D001、D113或 001X8。
[0019] 本发明的主要效果体现在：采用阳离子交换树脂吸附井闪羟胺A和，反应过程中， 生成的部分井闪霉素A吸附在阳离子交换树脂上，这样可促进井闪羟胺A进一步转化为井 冈霉素A，既可避免底物对酶抑制，也可避免产物对酶的抑制，所制备的井闪霉素A产品产 率和纯度提高。 (四）【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体实例对本发明进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0021] 实施例1 :
[0022] 在100mL001X7强酸性阳离子交换凝胶树脂（杭州争光树脂有限公司）中加入 200mL含0. 5 %g/mL井冈羟胺A溶液，充分搅拌，使井冈羟胺A吸附完全，过滤，用IOOmL去 离子水洗涤，备用。将已吸附井闪羟胺A的树脂加入到350mL水中，纤维二糖加量为I. 5g， 大肠杆菌湿菌体加量I. 8g，控制pH= 6. 0,在30°C、150rpm摇床上反应24h，用沙布过滤树 月旨，用去离子水洗去菌体，将树脂装柱，用0. 5mol/L氨水溶液洗脱，经HPLC跟踪检测，收集 井冈霉素A组分，在40°C下-0. 95~-0. 98大气压条件下浓缩，冷冻干燥获得产品0. 85g， 经HPLC检测，（用日本岛津20A高效液相色谱仪检测，检测条件：流动相为含2. 5%甲醇 和0. 18%Na2HPO4 ? 12H20的水溶液，pH7. 0,流速I.OmL/min，检测波长为210nm)纯度为 95. 5%〇
[0023] 实施例2 :
[0024] 在100LDOOl强酸性阳离子交换大孔树脂（杭州争光树脂有限公司）中加入200L 含0. 8 %井闪羟胺A(W/V)溶液，充分搅拌，使井闪羟胺A吸附完全，过滤，用100L去离子水 洗涤，备用。用已吸附井闪羟胺A的树脂加入到400L水中，纤维二糖加量为2.Okg，大肠杆 菌湿菌体加量2. 0kg，控制pH= 6. 0,在35°C下搅拌反应24h，用沙布在三脚式离心机离心 过滤树脂，用100L去离子水洗去菌体，将树脂装柱，用0. 8mol/L氨水溶液洗脱，经HPLC跟 踪检测，收集井闪霉素A组分，在35°C下真空度-0. 98大气压条件下浓缩，喷雾干燥（进口 温度为180°C，出口温度70°C)获得产品I. 8kg，经HPLC检测，纯度为96. 3%。
【主权项】
1. 一种井闪霉素A的制备方法，其特征在于，所述方法为先将井闪羟胺A吸附在阳离 子树脂上，以大肠杆菌湿菌体作为糖基转移酶催化剂，在水中加入纤维二糖，使其在水中终 浓度为〇. 05~1. 5% g/mL，在反应温度为25~35°C，pH为5. O~7. O的条件下进行反应 12~48h ;反应结束后，过滤取滤饼用0. 2~I. 2mol/L氨水溶液洗脱，经HPLC跟踪检测收 集井冈霉素A组分，浓缩后喷雾干燥或冷冻干燥，制备获得井冈霉素A，所述的井冈羟胺A与 纤维二糖的质量比为I :1. 5-2. 5。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的将井闪羟胺A以井闪羟胺水溶液的形 式吸附在阳离子树脂上，并按如下步骤操作：在阳离子交换凝胶树脂中加入含井闪羟胺A 的水溶液，充分搅拌，使井闪羟胺A吸附完全，所述的阳离子交换凝胶树脂与井闪羟胺A水 溶液的体积比为1 :〇. 8~1. 5所述的井冈羟胺A水溶液的浓度为0. 3-0. 8% g/mL。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的大肠杆菌湿菌体的用量以井闪羟胺A 质量计为〇. 5~2. Og/g。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的浓缩是在< 50°C下真空浓缩，再干燥 获得广品。5. 如权利要求1~4之一所述的方法，其特征在于所述阳离子树脂为下列之一：强酸 型阳离子交换凝胶树脂、弱酸型阳离子交换凝胶树脂、强酸型阳离子交换大孔树脂或弱酸 型阳离子交换大孔树脂。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于所述阳离子树脂为下列之一 ：001X7、 001X4、D001、D113 或 001X8。
【专利摘要】一种井冈霉素A的制备方法，所述方法为先将井冈羟胺A吸附在阳离子树脂上，以大肠杆菌湿菌体作为糖基转移酶催化剂，在水中加入纤维二糖，使其在水中终浓度为0.05～1.5％g/mL，在反应温度为25～35℃，pH为5.0～7.0的条件下进行反应12～48h；反应结束后，过滤取滤饼用0.2～1.2mol/L氨水溶液洗脱，经HPLC跟踪检测收集井冈霉素A组分，浓缩后喷雾干燥或冷冻干燥，制备获得井冈霉素A，所述的井冈羟胺A与纤维二糖的质量比为1：1.5‐2.5。本发明采用阳离子交换树脂吸附井冈羟胺A和井冈霉素A，既可避免底物对酶抑制，也可避免产物对酶的抑制，所制备的井冈霉素A产品纯度高。
【IPC分类】C12P19/46, C12R1/19
【公开号】CN105002236
【申请号】CN201510253870
【发明人】陈小龙, 范永仙, 陆跃乐, 沈寅初
【申请人】浙江工业大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年5月18日