复合酶法拆分制备旋光纯r－（－）坦索洛新的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于手性化合物制备领域，涉及旋光纯坦索洛新的制备方法，特别涉及以 复合酶催化拆分制备R-（一）坦索洛新的方法。
【背景技术】
[0002] 盐酸坦索洛新（tamsulosinhydrochloride)化学名称为（R)_(5) [2-[[2_2_ 氧基 苯氧基]一乙基]氨基]丙基]一 2-甲氧基苯磺酰胺盐酸盐，是由日本山之内制药公司 研发的aIa-肾上腺素受体拮抗剂。1992年7月通过美国FDA批准，1993年首次在日本 上市，商品名为FLOMAX，1996年在中国上市，商品名为哈乐（HARNAL)，本品可降低前列腺平 滑肌张力，改善因前列腺肥大而引起的排尿障碍，临床主治良性前列腺增生。
[0003] 坦索洛新属于手性药物，它的外消旋体制备方法为已知的方法（CN- 102206176A)，即将4 一甲氧基一 3 -磺酰胺基苯丙酮与甲酸胺在钯一碳催化下得到关键中 间体5 -（2 -胺基丙基）一 2 -甲氧基苯横酰胺，再与2 -（2 -乙氧基苯氧基）溴乙烧缩 合反应，制备成坦索洛新外消旋体（RS)- 5 - [2 - [[2 - [2 -乙氧基苯氧基]乙基]氨 基]丙基]一2-甲氧苯磺酰胺。
[0004] 目前市场上销售的坦索洛新外消旋体均以化学法来完成拆分和消旋。但是化学拆 分法存在收率低，拆分剂消耗大以及反应条件苛刻等缺陷。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术缺陷，提供了复合酶法拆分制备旋光纯R-（一）坦索洛新的 方法，以达到反应条件温和，选择性高和收率高的目的。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取下述技术方案来实现： 坦索洛新的结构式：
坦索洛新的分子式：C20N28N205S 分子量：408. 51 CAS号：106133 - 20 - 4 熔点：226 - 228°C. 坦索洛新的结构式如式I所示，为手性化合物。而作为药物应用的坦索洛新需要得到 旋光纯的R-（一）坦索洛新然后进一步盐酸化。
[0007] 因此本发明提供了一种复合酶法拆分制备旋光纯R-（一）坦索洛新的方法，以坦 索洛新外消旋体为底物，在固定化重组脂肪酶B和重组消旋酶的耦合作用下进行转化，完 成坦索洛新的动态动力学拆分，得到旋光纯R-（一）坦索洛新。
[0008] 由式I所示，坦索洛新的手性中心为一甲基基团，因此本发明选择脂肪酶 B(CALB)，消旋酶(海因酶）对其外消旋体的拆分，该酶系具有在疏水性很差的溶剂中仍具有 较高的活性。
[0009] 脂肪酶是一类丝氨酸水解酶通常其活动中心是一个由天冬氨酸一组氨酸一丝氨 酸或组氨酸一丝氨酸一谷氨酸组成的三联体，在催化反应中丝氨酸的羧基向底物酯类或酰 胺中的羰基碳原子发起亲核进攻，形成酶一酰胺中间体，随后其它亲核试剂如水，胺，醇和 过氧化氢等进攻酶一酰基中间休，酶将酰基转移到酰基受体上，而自身复原又可以重复这 一过程。
[0010] 脂肪酶的催化活动中心匹配的对映反应速度高于不匹配的对映实体，实现对外消 旋体的拆分，在外消旋动力学拆分的同时，慢反应对应的对映体在催化剂的作用下持续外 消旋化，转化为快反应对映体，这样目标产物即单一对映体，理论产率可以达到100%。
[0011] 动态动力学拆分（DKR)是底物外消旋化和对映体拆分同时进行的过程，底物的一 种对映体连续外消旋化最终实现构型翻转，这就是成功的进行DKR的重要组成部分，然而 底物的外消旋动力学拆分是各自要特定的反应条件的，因此必须考虑平衡这两方面的因 素。
[0012] 为了解决动力学拆分最大的理论产率问题，需要在动力学拆分方法中增加一个未 知反应的对映体的循环过程，主要的方法有分离，对映体的消旋重复拆分，但是分离只是简 单的针对反应过的对映体，而没有充分利用底物，只能缩短反应时间，最大理论产率仍然没 有改变。由于脂肪酶只能针对一种特定的对映体反应，不能与另一构象的对映体反应，不能 改变最大产率只有50%的缺陷。
[0013] 金属一酶配伍的DKR是近10年来取得很大进展，其中主要是过渡金属配合物与脂 肪酶B配伍为主。过渡金属的外消旋有两种方式，1是通过氢转移反应来实现外消旋，2是 通过形成一烯丙基来产生外消旋化作用，其中铑，钯，钌的配合物显示出良好的外消旋 催化性能，其理论产率可达100%，但是，过渡金属的价格贵，而且含有残留物。
[0014] 而本发明选择用消旋酶取代过渡金属，价格低，无残留，收率高。消旋酶的种类繁 多，目前主要用于氨基酸的改型即DL的转型上。
[0015] 作为本发明的一种实施方式，选择脂肪酶为南极假丝酵母 产的脂肪酶13(041^)，消旋酶为恶臭假单胞菌（/5616^〇^?〇/?(36 1/^2^/(3)产的海因酶。
[0016] 而南极假丝酵母菌和恶臭假单胞菌均可为市售可得。
[0017] 脂肪可分顺式和反式两种分子结构，而能兼顾二者的脂肪酶同时对水溶液和非水 溶液都的很强的催化作用的属南极假丝酵母产的脂肪酶B(CALB)。
[0018] 消旋酶为恶臭假单胞菌产的海因酶（hycjan〇inaSe，EC3. 5. 2. 2)，目前海因酶主 要用于生产D-对羟基苯甘氨酸，尚未有用于生产坦索洛新类化学物的报道。
[0019] 南极假丝酵母产的脂肪酶B和有恶臭的假单胞菌产的海因酶，产酶菌均为野生 菌，它们的酶表达量均较低，产酶活低和产酶量亦低，不适宜直接用于产业化。因此为提高 其酶表达量和酶活，分别将南极假丝酵母脂肪酶B基因组和恶臭假单胞菌海因酶基因组重 组整合到毕赤酵母（/3ZcAia 中表达。
[0020] 毕赤酵母作为真核异源蛋白的宿主菌，易于遗传操作，还具有以下优势：1。以甲醇 为碳源，其表达载体含特有的乙醇氧化酶AOXl基因启动子，能通过甲醇诱导AOXl调控外源 基因表达。2。高效表达，毕赤酵母生长快，能表达很高的细胞浓度，外源蛋白表达可达细胞 总蛋白的5 - 40%。3。适于表达胞内或胞外外源蛋白。4。高稳定性，插入的外源基因不 存在自主复制的表达载体中是和表达载体一起整合到酵母染色体上，随染色体一起复制和 遗传，避免了外源基因的丢失现象。5。毕赤酵母能对所分泌的蛋白进行N- 0-糖其化修 饰，且糖基化程度适中。6。适应性强，易于处理，可以在廉价的非选择性培养基中生长。7。 可进行转录的修饰。8。可对外源基因的多拷贝。
[0021] 因此本发明选择毕赤酵母来表达南极假丝酵母脂肪酶B和恶臭假单胞菌海因酶 基因。
[0022] 此外，基因剂量对外源目的蛋白表达有重要影响，一个拷贝的外源蛋白表达盒足 够外源蛋白的高表达，增加拷贝数既有正效应也有负效应，各自影响机理不同，要提高拷贝 数既起正效应作用，因随基因剂量增大，会增加外源蛋白基因转录水平，外源蛋白的产生要 经过转录，翻译执叠，糖基化与分泌等步骤，而且需要细胞能量的供给，不可少一个步骤，它 会因"菌株一表型一外源蛋白"的特定组合以及细胞不同的生理状态而异。
[0023]本发明选用的外源基因表达的毕赤酵母由Invitrogen公司提供的试剂盒构建， 转化酵母细胞表达载体均能在大肠杆菌埃希氏菌GSl15表达，分泌型载体所含有的信号肽 有：pPICZX和pPIC9K的a-pact的序列。因为毕赤酵母中没有稳定的天然质粒，所以携 带外源基因的重组载体必须整合到酵母染色体才能实现外源基因的表达。整合方式有单交 换和双交换两种，单交换整个更具强的遗传稳定性。
[0024]为了简单快速获得高表达的转化分子，要进行目的基因高拷贝克隆的筛选，因此 就需要在载体上引入抗体基因，如抗G418(Kanamycin)的基因，就可以通过提高G418的 浓度来选高拷贝表达克隆。
[0025]也可通过筛选标准化来达到高拷贝转化子的外源基因拷贝数，S卩：多拷贝单元，可 以通过整合时的重复发生得以实现发生频率通常为5 - 10%，为了筛选出高拷贝数转化子， 可以采取菌落杂交(或打印迹杂交）或增加抗生素浓度(如G418)等方法来进行。
[0026]增加外源基因拷贝数，会增加外源基因的转录水平，但外源基因蛋白的产生要经 过转录翻译、折叠、糖基化分泌等步骤，缺一不可。
[0027] 若蛋白质分子量在60Kda以上，则采用mu+sHis基因型，若蛋白质分子量在20Kda 以下，则采用mu+His基因型，启动子有多种组成型：有3 -磷酸甘油醛脱氢酶FLDl启动 子，PFLDl还有PEX8启动子(属于弱启动子)，因为启动子是基因表达的关键元件，直接关系 到表达水平。最常用的启动子AOXl仅受甲醇诱导，但此启动子不适用于食品工业，因大量 甲醇的存在有火灾隐患。可以选用不以甲醇为唯一诱导物的PGAP/PFLD/PDAS和PADX2， 还例如从毕赤酵母基因组文库中克隆到一个新的3-磷酸甘油脱氢酶基因（GAP)的启动子 PGAP/可在多种碳源如葡萄糖、甘油、甲醇或油酸诱导下表达。
[0028]信号肽序列： 表达蛋白的分泌需要信号肽引导并沿一定途经才能分泌至细胞外，毕赤酵母一般利用 两种来源信号肽序列，一是外源基因本身携带的信号肽序列，但酵母表达系统不能完全利 用外源蛋