一种日本对虾分子标记方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学DNA分子遗传标记技术，具体涉及海洋经济动物日本对虾 分子标记方法及应用。
【背景技术】
[0002] 日本对虾又名花虾、竹节虾、花尾虾、斑节虾、车虾，广泛分布在印度洋、太平洋地 区，中国江苏省以南沿海也有分布。日本对虾具有生长迅速、抗病力强、离水长时间不死，适 合长途干运活销，是重要的创汇渔业虾类。日本对虾营养丰富，含蛋白质是鱼、蛋、奶的几倍 到几十倍；还含有丰富的碘、钾、镁、磷等矿物质及维生素A、氨茶碱等成分，且其肉质和鱼 一样松软，易消化，不失为老年人使用的营养佳品，对健康极有裨益；对身体虚弱以及病后 需要调养的人也是极好的食物。故养殖日本对虾对于养殖户来说是一个极好的收益。
[0003] 但养殖的快速发展而产生的病害使得日本对虾资源迅速衰减，尤其自90年代虾 病爆发以来，日本对虾养殖业受到重挫，虾病的流行使得对虾抗病品系选育成为必需要解 决的问题。目前，国内的渔业遗传改良主要以群体选育为主，但群体选育获得的后代，其个 体间亲缘关系不明确，选育过程中不可避免地造成近交和遗传多样性的丢失。因此，品系改 良需要用更精确的选育方法来进行。这些方法急需找到一种能够有效鉴别出不同家系的标 记，从而清楚选育群体的亲缘关系，了解系谱信息，有效减少近交，且合理高效地利用选育 群体。
[0004] 中国专利公告号CN100532573C，公告日2009年8月26日，名称为太平洋牡蛎 EST微卫星标记的筛选方法，该申请案公开了一种太平洋牡蛎EST微卫星标记的筛选方法， 包括利用GeneBank公布的太平洋牡的ESTs的序列，利用微卫星检索软件SSRhunter进 行微卫星位点的查找，对于2-6个碱基重复单元重复次数大于5的微卫星片断进行筛选分 离，从而得到含有微卫星重复的ESTs序列；然后在微卫星重复序列两端的侧翼序列设计引 物，并进一步检测优化引物成为微卫星标记；最后对微卫星标记的重复性、稳定性和多态性 进行综合评价，得到微卫星标记。其不足之处在于，不适用于日本对虾家系的标记的检测与 应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于为了解决现有鉴别出不同日本对虾家系的标记复杂、耗时长的 缺陷而提供一种方便快捷的日本对奸分子标记方法。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供一种日本对虾分子标记的应用。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 一种日本对奸分子标记方法，所述日本对奸分子标记方法包括以下步骤： 1) 提取DNA基因组：取日本对虾组织150-200mg，剪碎后按照苯酚氯仿提取法提取DNA 基因组，在〇-4°C下保存备用； 2)PCR扩增：以步骤1)得到的DNA基因组为模板进行PCR扩增，用于扩增的特异引物 命名为L10985 与H11563,得到PCR扩增产物；其中，L10985:5' -TGAGGAGGTTTCGCAGTA-3' ；H11563:5' -AGATGAGGGTGAGTGGGT-3' ； 3)产物鉴定：将步骤2)得到的PCR扩增产物在I. 5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭 染色，在凝胶成像系统下观察并拍照记录。
[0008] 在本技术方案中，分子标记是以个体间生物的大分子，尤其是生物体的遗传物质 DNA核苷酸序列变异为基础的遗传标记。其发展对动物遗传学产生了革命性的影响，与传统 的遗传标记如形态标记、细胞学标记与同工酶标记相比，分子标记技术可以快速直接的观 察和探究到整个基因组的基因变异。此外还具有共显性，数量极多，多态性高，不受发育时 期、季节、环境限制等优点。
[0009] 在辅助育种过程中，利用DNA分子标记技术可以对日本对虾的重要经济性状（包 括抗病、抗逆和选育高产品种）紧密连锁的基因进行辅助选择，缩短育种年限，大大提高效 率。
[0010] 作为优选，步骤2)中PCR反应体系总体积为50yL，包括DNA基因组50-100mg、 IOXBufTer5-10yUdNTP0? 2-0. 3mmol/L、特异引物L10985、H11563 各 0? 2-0. 4ymol/L、 TaqplusDNA聚合酶 2-4U和氣化儀L5-1. 8mmol/L〇
[0011] 作为优选，PCR反应条件为：94°C预变性4min、94°C变性30s、50°C退火45s、72°C延 伸45s，30个循环后，在72°C延伸7min。
[0012] 作为优选，PCR扩增产物在1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离，电泳缓冲液为0. 5XTBE， 其pH为8. 0,电泳时间为1-1. 5h，加入溴化乙锭至终浓度500ng/mL染色，然后在凝胶成像 系统下观察并拍照记录。
[0013] 一种日本对虾分子标记的应用，所述应用为筛选日本对虾种质资源多样性分析、 遗传多样性分析、家系鉴定、分子群体遗传学研究、遗传图谱构建、重要经济性状定位、功能 基因研究与辅助日本对奸分子遗传育种或养殖。
[0014] 在本技术方案中，分子标记技术可以在DNA水平上寻找和检测与疾病相关的基 因，在辅助育种过程中，利用DNA分子标记技术可以对日本对虾的重要经济性状（包括抗 病、抗逆和选育高产品种）紧密连锁的基因进行辅助选择，缩短育种年限，大大提高效率。 从而对某些疾病做出检测，并作出判断。分子标记技术也可以对病原菌进行检测、分类以及 遗传关系的鉴定，掌握致病菌不同时期的存活情况，从而有效的控制和避免日本对虾大规 模病害的爆发。
[0015] 对遗传多样性及系统发育研究来说，培养优良性状品种的前提条件是丰富的遗传 多样性资源，而丰富的遗传多样性资源也会为养殖业带来巨大的经济效益，应用分子标记 技术，能有效的分析日本对虾种内或中间的系统发育和遗传多样性。
[0016]DNA分子标记可以使高密度和高覆盖率的日本对虾遗传连锁图谱不断完善，对基 因定位、遗传育种等领域具有重大意义，而重要经济性状基因的标记和克隆，对培育日本对 虾遗传优良，培育优质高产健康品种具有很大的意义。
[0017] 本发明的有益效果： 1) 本发明可快速的获得日本对虾的遗传标记基因座位的遗传变异多态性图谱，方法简 便快捷，可直观的观察到结果； 2) 本发明主要应用于日本对虾群体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建； 3)本发明检测迅速、费用低，用途更为广泛。
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【具体实施方式】
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[0020] 以下结合具体实施例对本发明做进一步的解释： 实施例1 一种日本对奸分子标记方法，所述日本对奸分子标记方法包括以下步骤： 1) 提取DNA基因组：取日本对虾组织150mg，剪碎后放入I. 5mL离心管中，加入500y1 缓冲液（lOmmol/LTris-HCl，pH8.0 ;50mmol/LEDTA，pH8.0)，混匀后加入终浓度为 1% 的SDS和200yg/ml的蛋白酶K，55°C水浴3h;12000转/min离心5min，取上清；向上清液 中加入与上清液等体积的Tris-饱和酚：氯仿：异戊醇混合液抽提一次，Tris-饱和酚：氯 仿：异戊醇体积比为25:24:1，然后12000转/min离心5min，取上清液，向上清液中加入与 上清液等体积的氯仿：异戊醇混合液抽提一次，氯仿：异戊醇的体积比为24:1，5000转/ min离心5min，取上清液；向上清液中加入两倍上清液体积的无水乙醇沉淀，然后70%乙醇 洗涤沉淀两次，用TBE溶解；紫外分光光度计测定样品DNA的0D260、0D280值，确定其浓度 和纯度，4°C保存备用；共17个样品； 2) PCR扩增：以步骤1)得到的DNA基因组为模板进行PCR扩增，用于扩增的特异引物命 名为L10985 与H11563,得到PCR扩增产物；其中，L10985:5' -TGAGGAGGTTTCGCAGTA-3' ； H11563:5' -AGATGAGGGTGAGTGGGT-3' ；其中，PCR反应体系总体积为 50yL，包括DNA基 因组IOOmgUOXBufTer10yUdNTP0? 3mmol/L、特异引物L10985、H11563 各 0? 4ymol/L、 TaqplusDNA聚合酶4U和氯化镁1.8mmol/L;PCR反应条件为：94°C预变性4min、94°C变性 3〇8、50°(：退火458、72°(：延伸458,30个循环后，在72°(：延伸7111111 ; 3) 产物鉴定：将步骤2)得到的PCR扩增产物在1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离，电泳缓冲 液为0. 5XTBE，其pH为8. 0,电泳时间为I. 5h，加入溴化乙锭至终浓度500ng/mL染色，然后 在凝胶成像系统下观察并拍照记录。
[0021] 实施例2 一种日本对奸分子标记方法，所述日本对奸分子标记方法包括以下步骤： 1) 提取DNA基因组：取日本对虾组织180mg，剪碎后放入I. 5mL离心管中，加入500y1 缓冲液（lOmmol/LTris-HCl，pH8.0 ;50mmol/LEDTA，pH8.0)，混匀后加入终浓度为 1% 的SDS和200yg/ml的蛋白酶K，55°C水浴3h;12000转/min离心5min，取上清；向上清液 中加入与上清液等体积的Tris-饱和酚：氯仿：异戊醇混合液抽提一次，Tris-饱和酚：氯 仿：异戊醇体积比为25:24:1，然后12000转/min离心5min，取上清液，向上清液中加入与 上清液等体积的氯仿：异戊醇混合液抽提一次，氯仿：异戊醇的体积比为24:1，5000转/ min离心5min，取上清液；向上清液中加入两倍上清液体积的无水乙醇沉淀，然后70%乙醇 洗涤沉淀两次，用TBE溶解；紫外分光光度计测定样品DNA的0D260、0D280值，确定其浓度 和纯度，4°C保存备用；共17个样品； 2)PCR扩增：以步骤1)得到的DNA基因组为模板进行PCR扩增，用于扩增的特异引物 命名为L10985 与H11563,得到PCR扩增产物；其中，L10985:5' -TGAGGAGGTTTCGCAGTA-3' ； H11563:5' -AGATGAGGGTGAGTGGGT-3' ；其中，PCR反应体系总体积为 50yL，包括DNA基 因组 50mg、10