转录组文库及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及高通量测序文库构建领域，具体而言，涉及一种转录组文库及其构建 方法。
【背景技术】
[0002] 转录组测序（Transcriptomesequencing)主要通过高通量测序研究特定组织或 细胞在某个时期转录出来的mRNA。转录组测序可全面快速地获得某一物种特定细胞或组织 在某一状态下的几乎所有的转录本及基因序列，可以用于研究基因结构和基因功能、可变 剪接和新转录本预测等。
[0003] 目前，转录组文库构建步骤中，通常要先将核糖体RNA从总RNA中去除，以避免大 量的核糖体RNA对测序的影响。去除了核糖体的RNA再利用随机引物进行逆转录，得到 cDNA。这样既消除了核糖体RNA的影响又保证了全长cDNA的产出。
[0004] 普通转录组文库构建时首先要对总RNA进行检测，检测合格的样品才能进行后续 建库。而合格的样品需要满足以下四个方面的要求：（1)样品的量：无论真核生物还是原核 生物总RNA的量均需3I. 5ug。（2)样品浓度：真核生物的浓度需要3 50ng/y1 ;原核生物 的浓度3 65ng/yl。（3)样品纯度：0D260/280要兰1.8;28S/18S要兰1。（4)尺熟完整性： 植物或真菌的RIN值要会6. 5 ;动物的RIN值要会7. 0 ;原核生物的RIN值要会6. 0。
[0005] 普通转录组文库构建过程中，利用〇1igodT磁珠，从总RNA纯化得到mRNA，经过片 段化（200bp左右）、合成一链和二链cDNA，然后再通过末端修复、加A、连接接头和PCR富集 步骤得到最终的cDNA文库。操作过程中需多次利用AMPureXP磁珠纯化以去除反应体系 中非目标小片段。
[0006] 普通转录组文库构建的流程如下：（I)mRNA纯化；（2)RNA片段化；（3)第一链cDNA 合成；（4)第二链cDNA合成；（5)双链cDNA纯化；(6)末端修复和加腺苷酸A; (7)接头的连 接；（8)片段选择加接头的DNA; (9)USER酶消化和PCR富集；（10)PCR产物纯化。
[0007] 上述文库构建过程中不涉及PCR扩增的步骤，直接是对mRNA反转录来的双链cDNA 进行后续建库流程，这样所构建的文库高度忠实于特定细胞或组织在特定状态下所转录出 来的mRNA，能够真实体现细胞的转录状态。
[0008] 由上述内容可知，目前普通转录组文库对样品质量要求较高，总RNA的量 3 1.5ug，对纯度及完整性也有一定要求。微量细胞起始量低，提取到的总RNA根本不能通 过电泳，而且用Qubit也无法检测到（5ng以下），更无法用安捷伦2100进行质量检测，无法 对其纯度及完整性进行判断，不能完成转录组文库构建。因此，仍需要对现有的转录组文库 的构建方法进行改进。
【发明内容】
[0009] 本发明的主要目的在于提供一种转录组文库及其构建方法，以解决现有技术中难 以实现微量起始细胞的转录组文库构建的问题。
[0010] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种转录组文库的构建方法， 该构建方法包括：以待测样本的总RNA为模板，利用MMLV逆转录酶进行逆转录，得到总RNA 中的mRNA的双链cDNA;对双链cDNA进行扩增，得到扩增cDNA;以及利用扩增cDNA进行片 段化文库构建，得到转录组文库。
[0011] 进一步地，利用01igodT引物和MMLV逆转录酶将待测样本总RNA中的mRNA逆转 录成双链cDNA。
[0012] 进一步地，待测样本的总RNA的量小于5ng。
[0013] 进一步地，MMLV逆转录酶为重组MMLV逆转录酶，重组MMLV逆转录酶包括 SMARTScribe?逆转录酶、Superscript?IV逆转录酶或Superscript?in逆转录酶。
[0014] 进一步地，以待测样本的总RNA为模板，利用MMLV逆转录酶进行逆转录，得到总 RNA中的mRNA的双链cDNA的步骤包括：步骤Sl，利用MMLV逆转录酶对总RNA中的mRNA进 行逆转录，得到第一链cDNA;以及步骤S2,以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，得到双 链cDNA。
[0015] 进一步地，在步骤SI和步骤S2之间，还包括对第一链cDNA进行磁珠纯化的步骤； 以及在步骤S2之后，还包括对双链cDNA进行磁珠纯化的步骤。
[0016] 进一步地，磁珠纯化步骤中的磁珠为SPRIAmpureXP磁珠。
[0017] 进一步地，在对双链cDNA进行磁珠纯化的步骤后，还包括对双链cDNA的长度和浓 度进行检测的步骤。
[0018] 进一步地，利用扩增cDNA进行片段化文库构建，得到转录组文库的步骤包括：对 扩增cDNA进行片段化，得到片段化DNA;对片段化DNA进行末端修复加A，得到修复DNA;对 修复DNA进行接头连接，得到含有带接头DNA和不带接头DNA的混合物；对混合物中的带接 头DNA进行分离，得到带接头的DNA;对带接头的DNA进行USER酶消化，得到消化DNA;以及 对消化DNA进行富集，得到转录组文库。
[0019] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种转录组文库，该转录组文 库采用权利上述任一种构建方法构建而成。
[0020] 应用本发明的技术方案，通过以总RNA为模板，在不去除核糖体RNA的情况下，通 过利用MMLV逆转录酶将总RNA中的mRNA逆转录成全长片段的双链cDNA;再对双链cDNA进 行扩增，以达到文库构建所需要的DNA的量，进而能够顺利实现后续片段化文库的构建。该 方法不仅能够富集完整全长的转录本（400bp~9000bp)，而且能够高敏感度、无偏好性地 扩增cDNA，因而还可以维持原始mRNA各转录本的丰度，从而能够实现微量样本的转录组文 库的构建。
【附图说明】
[0021] 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0022] 图1示出了根据本发明的一种优选的实施例中转录组文库构建的流程示意图；
[0023] 图2示出了根据本发明的一种优选的实施例中转录组文库构建的详细流程示意 图；
[0024]图3示出了本发明的一优选的实施中转录组文库构建过程中所得到的扩增cDNA 的安捷伦2100检测结果；以及
[0025]图4示出了本发明的另一优选的实施中转录组文库构建过程中所得到的扩增 cDNA的安捷伦2100检测结果。
【具体实施方式】
[0026] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
[0027] 如【背景技术】部分所提到的，目前转录组文库的构建方法是直接利用从总RNA中去 除核糖体RNA(以避免大量的核糖体RNA对测序的影响），分离得到的mRNA进行逆转录得到 的cDNA进行文库构建，中间不经过PCR扩增的步骤，减少了PCR扩增所带来的偏好性或错 误率，使得所构建的转录组文库能够相对真实地体现细胞或组织某一状态下的转录状况。 然而，上述构建方法对样品总RNA的量要求较高，对细胞数目较少（如少于IO4~10 5细胞 个数）的样品而言，无法提取得到满足上述文库构建要的总RNA的量。
[0028] 为了解决现有技术中的上述状况，在本发明一种典型的实施方式中，提供了一种 转录组文库的构建方法，如图1所示，该构建方法包括：以待测样本的总RNA为模板，利用 MMLV逆转录酶进行逆转录，得到总RNA中的mRNA的双链cDNA;对双链cDNA进行扩增，得到 扩增cDNA;利用扩增cDNA进行片段化文库构建，得到转录组文库。
[0029] 本发明的上述转录组文库的构建方法，通过以总RNA为模板，在不去除核糖体RNA 的情况下，利用MMLV逆转录酶将mRNA逆转录成双链cDNA，能够从相对少量的总RNA模板 中逆转录得到mRNA全长片段（400bp~9000bp)的双链cDNA;然后对获得的长片段的双链 cDNA进行扩增，以达到文库构建所需要的DNA的量，进而能够顺利实现后续文库的构建。该 方法能够满足高敏感度、无偏好性的cDNA转录本的扩增，能够富集完整全长的转录本，并 且可以维持原始mRNA各转录本的丰度，从而能够实现微量样本的转录组文库的构建。
[0030] 由于逆转录得到较长的片段相比得到较短的片段难度相对较大，因而在现有的转 录组文库构建过程中，通常是从总RNA中分离得到mRNA后，先对mR