从生物组织分离细胞的方法
【技术领域】
本发明涉及从生物组织分离细胞的方法。更详细地，涉及通过调整蛋白质分解酶的使用量，能够有效地稳定并分离具有高的生物活性的细胞的方法。
【背景技术】
在哺乳类、鸟类、爬行类及鱼类等多细胞动物的肝脏、胰脏、肾脏、牙周组织、皮肤、软骨、骨及神经组织等各种脏器及组织、以及ES细胞组织、诱导性多能干细胞(iPS细胞)的原材料用纤维芽细胞组织中存在的细胞或细胞集合体(细胞簇)的酶的离析在细胞移植或细胞株建立、治疗及诊断、检查等广泛的用途中有用。例如，正在进行通过将从胰脏离析的胰岛移植给患者来治愈糖尿病的医疗。在胰岛移植中，在胰脏组织中存在的称为胰岛的细胞集合体的分离是必须的，此时，需要使胰岛不受到损坏地分解胰脏组织，将胰岛分离。另夕卜，正在通过将从肝脏分离的肝细胞移植给患者，进行肝功能衰竭等的治疗。
为了使生物组织解离，从而使生物组织所含有的细胞或细胞集合体游离，需要使细胞等游离为所希望的程度，并从生物组织的其他部分分离。通过酶的离析，将细胞等从生物组织分离时，需要用胶原酶等蛋白质分解酶对细胞间基质进行处理。
生物组织由细胞和细胞间基质(细胞间物质)构成。细胞间物质是连接细胞的物质，其具有结构物和无结构物。结构物有胶原纤维、弹性纤维及网状纤维等纤维。无结构物是填充在纤维之间的成分并被称为基质的、溶胶或凝胶状的物质，其有糖蛋白质及蛋白聚糖。
细胞间物质的代表为称为胶原蛋白(Collagen)的蛋白质，其占生物体内总蛋白质重量的约1/3。胶原蛋白呈纤维结构，并被正式地称为胶原蛋白纤维、胶原纤维。
组织大致分为上皮组织、支持组织、肌肉组织及神经组织4种。上皮组织为覆盖身体或脏器表面的组织且细胞密度高、细胞间物质不介于其间。支持组织起到支持身体、脏器及细胞等的作用，并包括结缔组织、软骨组织、骨组织、血液及淋巴。肌肉组织为以收缩运动为目的的分化后的细胞的融合，细胞间物质所占的比例极少。肌肉组织虽然由肌细胞、结缔组织、血管及神经构成，但主要的结构物为肌纤维。神经组织主要构成神经内膜和神经束膜，均含有大量细胞间物质(胶原蛋白)。
结缔组织为支持组织之中的I种，是指脂肪组织和纤维性结缔组织。作为纤维性结缔组织的构成成分，有胶原纤维、弹性纤维。另外，纤维性结缔组织大致分为疏水性结缔组织和致密结缔组织。疏水性结缔组织是指采用胶原蛋白不规则排列的纤维性结缔组织，并分布于皮下组织、粘膜组织、神经、血管外膜及小叶间组织等。
构成胶原蛋白的肽链的氨基酸具有如下特征:具有甘氨酸-氨基酸X-氨基酸Y”和甘氨酸每3个残基重复的一级结构。已知人胶原蛋白有约30种分子种类存在。在体内存在最丰富的是纤维性的I型胶原蛋白。非纤维性的胶原蛋白IV也大量含有，并介由分子间二硫键互相连结，参与网状组织的形成(非专利文献I)。报告了在胰岛和内分泌组织之间，存在胶原蛋白VI (非专利文献2、3)。
关于组织分解用酶，就来自溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)的各种粗胶原酶而言，除了胶原酶以外，还包括各种蛋白酶(胶原蛋白分解活性及非特异性蛋白质分解活性)和非蛋白酶成分(磷脂酶等)。正在进行利用这种粗胶原酶从大部分生物组织的细胞及细胞簇的酶的分离。
已知胰岛组织也通过选自来自溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)的2种胶原酶(ColG及ColH)、蛋白酶(嗜热菌蛋白酶、分散酶或来自溶组织梭菌的中性蛋白酶(NP))的蛋白质分解酶来分解(专利文献1、2)。例如，已知优选使用溶组织梭菌生产的2种胶原酶及I种中性金属蛋白酶(非专利文献4)。报告了从生物组织对细胞等进行酶的分离时，在分离的细胞等的收率及生物活性方面，2种胶原酶起着重要的作用(非专利文献5)。
另外，报告了与酶混合物示出的α-N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐(BAEE)分解活性成比例，从人的胰脏的胰岛分离数多(专利文献I及非专利文献6)。作为具有BAEE分解活性的酶，溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)产生的梭菌蛋白酶(CP)是已知的。
生物组织中的细胞间基质的状态(特别是胶原蛋白的含量)根据物种、年龄、性别、组织、生活环境等的不同而不同。胶原蛋白在哪个组织的哪种状态的基质中，含有怎样的程度尚未明确。胶原蛋白从哺乳类至鱼类广泛地存在，由各个物种引起的结构胶原蛋白的不同也不明确。
认为对于特定类型的胶原蛋白是否在生物组织中的基质中存在，可通过使用针对各类型的胶原蛋白的抗体的免疫染色来决定。但是，由于胶原蛋白的种类多，胶原蛋白广泛存在于多细胞动物，因此抗体的制造难等成为瓶颈，其实现困难。
现有技术文献:
专利文献
专利文献1:国际公开第1996/00283号专利文献2:国际公开第1998/24889号非专利文献
非专利文献 l:1noue et al.，J Cell B1l，97，1524-1539 (1983)
非专利文献 2:SJ Hughes P McShane, Transplant Proceedings,37，3444-34445(2005)
非专利文献 3:SJ Hughes，A Clark, P McShane, Transplantat1n,81(3)423-426(2006)
非专利文献 4:E Linetsky et al.，Diabetes，46，1120-1123 (1997)
非专利文南犬 5:D Brandhorst et al.， Transplantat1n Proceedings，37(8)，3450-3451(2005)
非专利文献 6:H Brandhorst et al.，Transplantat1n，87 (3)，370-375 (2009)
【发明内容】
发明要解决的课题
从生物组织分离细胞或细胞集合体时，不将作为分离对象的细胞等表面分解或损坏，通过蛋白质分解酶仅将构成生物组织的细胞间基质及脏器的各种结构蛋白质分解是不容易的。另外，如上所述，生物组织中的细胞间基质的状态(特别是胶原蛋白的含量)根据物种、年龄、性别、组织、生活环境等的不同而不同。特别是关于胶原蛋白，年龄增加导致的物性的变化显著。
虽然已知根据人的脏器的情况、年龄、性别、生活习惯、病历等不同，对蛋白质分解酶的活性是不同的，但情况是至今未开发出决定最适合的分解酶的种类、量的方法，只能根据经验决定酶的种类或酶反应时间来进行离析。关于胰岛分离，医务人员根据某协议将酶的量设为大致一定，仅将分解时间作为变量，通过目视确认胰脏的分解程度，并进行胰脏的酶处理。因此，通过作为对象的胰脏的状态而获得的胰岛的数量和品质不统一。
鉴于上述情况，本发明的主要目的是提供一种能够从生物组织中有效地稳定并分离具有高的生物活性的细胞的细胞分离方法。
解决课题的方法
为解决上述课题，本发明提供以下的方法。
[1]一种从生物组织分离细胞的方法，其特征在于，使用分解酶组合物，所述分解酶组合物通过在一定量的中性蛋白酶和/或来自梭菌属(Clostridium, sp)的蛋白酶中，根据所述生物组织的主要蛋白质的组成加入该主要蛋白质的分解酶用量而形成。
[2]根据[I]记载的方法，其包括:决定所述生物组织的主要蛋白质的组成的步骤；在一定量的中性蛋白酶和/或来自梭菌属(Clostridium, sp)的蛋白酶中，根据决定的组成加入所述主要蛋白质的分解酶用量，调制分解酶组合物的步骤；利用调制的分解酶组合物处理所述生物组织的步骤。
根据该方法，可以由生物组织