L-氨基酸的制造方法

L-氨基酸的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种使用了棒状杆菌型细菌的L-氨基酸的制造方法。L-氨基酸作为 动物饲料用的添加物、调味料或饮食品的成分、或氨基酸输液等在工业上很有用。
【背景技术】
[0002] L-氨基酸例如可通过使用了具有L-氨基酸生产能力的各种微生物的发酵法进 行工业生产。作为利用发酵法的L-氨基酸的制造方法，例如可以举出：使用野生型微生物 (野生株）的方法、使用由野生株衍生的营养缺陷株的方法、使用由野生株衍生为各种药剂 抗性突变株的代谢调节突变株的方法、使用具有营养缺陷株和代谢调节突变株两者的性质 的菌株的方法。
[0003] 另外，近年来，利用重组DNA技术提高L-氨基酸生产能力的微生物被用于L-氨基 酸的制造。作为提高微生物的L-氨基酸生产能力的方法，例如可以举出：增强编码L-氨基 酸生物合成体系酶的基因的表达（专利文献1、专利文献2)、或增强碳源向L-氨基酸生物 合成体系的流入（专利文献3)。
[0004] 大肠杆菌（Escherichiacoli)具有至少2种无机磷酸摄入体系（非专利文献 1)。一方面为低亲和性的无机磷酸盐转运蛋白（low-affinityinorganicphosphate transporter;Pit)体系，另一方面为高亲和性的磷酸特异转运蛋白（high-affinity phosphate-specifictransporter;Pst)体系。作为编码Pit体系的基因，已知有pitA基 因及pitB基因。作为编码Pst体系的基因，已知有pstSCAB基因，pstSCAB基因的产物形 成复合物，作为Pst体系发挥作用。然而，未知这些磷酸盐转运蛋白的活性和L-氨基酸生 产的关联。
[0005] 现有技术文献
[0006] 专利文献
[0007] 专利文献1 :美国专利第5, 168, 056号说明书
[0008] 专利文献2 :美国专利第5, 776, 736号说明书
[0009] 专利文献3 :美国专利第5, 906, 925号说明书
[0010] 非专利文献
[0011]非专利文献 1 :R.M.Harrisetal.，JournalofBacteriology,Sept. 2001 ,p5008-5014

【发明内容】

[0012] 发明所要解决的课题
[0013] 本发明的课题在于，开发一种提高棒状杆菌型细菌的L-氨基酸生产能力的新型 技术，提供一种有效的L-氨基酸的制造方法。
[0014] 用于解决课题的手段
[0015] 本发明人为了解决上述课题进行了潜心研究，结果发现，通过以磷酸盐转运蛋白 的活性增大的方式对棒状杆菌型细菌进行修饰，可以提高棒状杆菌型细菌的L-氨基酸生 产能力，完成了本发明。
[0016]SP，本发明可如下例示。
[0017] [1]一种L-氨基酸的制造方法，其包括在培养基中培养具有L-氨基酸生产能力的 棒状杆菌型细菌及从该培养基中采集L-氨基酸，其特征在于，
[0018] 所述细菌以磷酸盐转运蛋白的活性增大的方式进行了修饰。
[0019] [2]如上述的方法，其中，通过使编码磷酸盐转运蛋白的基因的表达上升，磷酸盐 转运蛋白的活性增大。
[0020] [3]如上述的方法，其中，所述基因为pitA基因。
[0021] [4]如上述的方法，其中，所述pitA基因为下述（a)或（b)中记载的DNA:
[0022] (a)具有序列号5或25所示的碱基序列的DNA;
[0023] (b)在严格的条件下可与由序列号5或25所示的碱基序列的互补序列或与可自所 述互补序列制备的探针杂交的DNA，且其中所述可杂交的DNA编码具有磷酸盐转运蛋白活 性的蛋白质。
[0024] [5]如上述的方法，其中，所述pitA基因为编码下述㈧或⑶中记载的蛋白质的 DNA：
[0025] (A)具有序列号6或26所示的氨基酸序列的蛋白质、
[0026] (B)具有在序列号6或26所示的氨基酸序列中含有1或者多个氨基酸残基的取 代、缺失、插入、或添加的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有磷酸盐转运蛋白活 性。
[0027] [6]如上述的方法，其中，所述基因的表达通过提高该基因的拷贝数和/或修饰该 基因的表达调节序列来上升。
[0028] [7]如上述的方法，其中，通过在所述细菌中保持编码磷酸盐转运蛋白的突变型 pitA基因，磷酸盐转运蛋白的活性增大，所述磷酸盐转运蛋白具有相当于序列号6的246位 的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为苯丙氨酸以外的氨基酸残基的突变。
[0029] [8]如上述的方法，其特征在于，相当于序列号6的246位的苯丙氨酸残基的氨基 酸残基被取代为丝氨酸残基。
[0030][9]-种L-氨基酸的制造方法，其包括在培养基中培养具有L-氨基酸生产能力的 棒状杆菌型细菌及从该培养基中采集L-氨基酸，其特征在于，
[0031] 所述细菌保持有编码磷酸盐转运蛋白的突变型pitA基因，所述磷酸盐转运蛋白 具有相当于序列号6的246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为苯丙氨酸以外的氨基 酸残基的突变。
[0032] [10]如上述的方法，其特征在于，相当于序列号6的246位的苯丙氨酸残基的氨基 酸残基被取代为丝氨酸残基。
[0033] [11]如上述的方法，其中所述细菌是棒状杆菌属（Corynebacterium)细菌。
[0034] [12]如上述的方法，其中，所述棒状杆菌型细菌为谷氨酸棒状杆菌。
[0035] [13]如上述的方法，其中，所述L-氨基酸为L-谷氨酸。
[0036] [14]如上述的方法，其中所述L-谷氨酸是L-谷氨酸单铵或L-谷氨酸单钠。
[0037] [15]-种编码磷酸盐转运蛋白的DNA，所述磷酸盐转运蛋白具有对应于SEQID N0:6中246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为丝氨酸残基的突变。
[0038] [16] -种携带突变型pitA基因的棒状杆菌型细菌，所述突变型pitA基因编码具 有对应于SEQIDN0:6中246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为丝氨酸残基的突变 的磷酸盐转运蛋白。
【具体实施方式】
[0039] 下面，对本发明详细地进行说明。
[0040] 本发明的方法为一种L-氨基酸的制造方法，其包括在培养基中培养具有L-氨基 酸生产能力的棒状杆菌型细菌及从该培养基中采集L-氨基酸，其特征在于，上述细菌已经 以磷酸盐转运蛋白的活性增大的方式进行修饰。也将相同方法中所使用的棒状杆菌型细菌 称为"本发明的细菌"。
[0041] 〈1>本发明的细菌
[0042] 本发明的细菌为已经以磷酸盐转运蛋白的活性增大的方式进行修饰的具有L-氨 基酸生产能力的棒状杆菌型细菌。
[0043] 〈1_1>具有L-氨基酸生产能力的棒状杆菌型细菌
[0044] 在本发明中，所谓"具有L-氨基酸生产能力的细菌"是指在培养基中培养时，具有 生成目标L-氨基酸并在培养基中或菌体内蓄积到可回收的程度的能力的细菌。具有L-氨 基酸生产能力的细菌可以为能够在培养基中蓄积比非修饰株多的量的目标L-氨基酸的细 菌。作为非修饰株，可以举出野生株及亲株。另外，具有L-氨基酸生产能力的细菌可以为 能够在培养基中蓄积优选0. 5g/L以上、更优选1.Og/L以上的量的目标L-氨基酸的细菌。
[0045] 作为L-氨基酸，可以举出：L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-瓜氨 酸等碱性氨基酸；L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、甘氨酸等脂肪族氨基酸； L-苏氨酸、L-丝氨酸等作为羟基单氨基羧酸的氨基酸；L-脯氨酸等环式氨基酸；L-苯丙氨 酸、L-酪氨酸、L-色氨酸等芳香族氨基酸；L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-甲硫氨酸等含硫氨 基酸；L-谷氨酸、L-天冬氨酸等酸性氨基酸；L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺等侧链具有酰胺基 的氨基酸。本发明的细菌可以具有2个或其以上的氨基酸的生产能力。
[0046] 在本发明中，氨基酸只要没有特别记载，则均为L-氨基酸。L-氨基酸可以是游离 化合物、其盐、或其混合物。也就是说，在本发明中，术语"L-氨基酸"可以意指游离形式的 L-氨基酸、其盐、或其混合物。盐的例子包括例如硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、铵盐、钠盐、和钾 盐。例如，L-赖氨酸可以是游离形式的L-赖氨酸、L-赖氨酸的盐酸盐、L-赖氨酸的碳酸 盐、或其混合物。此外，L-谷氨酸可以是例如游离形式的L-谷氨酸、谷氨酸单钠（MSG)、谷 氨酸单铵、或其混合物。
[0047] 作为棒状杆菌型细菌，可以举出属于棒状杆菌（Corynebacterium)属、短杆菌 (Brevibacterium)属、及微杆菌（Microbacterium)属等属的细菌。
[0048] 作为棒状杆菌型细菌，具体而言，可以举出如下所述的种。
[0049] 嗜乙酰乙酸棒状杆菌（Corynebacteriumacetoacidophilum)
[0050] 醋谷氨酸棒状杆菌（Corynebacteriumacetoglutamicum)
[0051] 解烧棒状杆菌（Corynebacteriumalkanolyticum)
[0052] 帚石南棒状杆菌（Corynebacteriumcallunae)
[0053] 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum)
[0054] 百合棒状杆菌（Corynebacterium lilium)
[0055] 栖糖蜜棒状杆菌（Corynebacteriummelassecola)
[0056] 热产氨棒状杆菌（有效棒状杆菌）（Corynebacteriumthermoaminogenes(Coryne bacteriumefficiens))
[0057] 力士棒状杆菌（Corynebacterium herculis)
[0058] 散枝短杆菌（Brevibacteriumdivaricatum)
[0059] 黄色短杆菌（Brevibacteriumflavum)
[0060] Immariophilum 短杆菌（Brevibacterium immariophilum)
[0061] 乳酸发酵短杆菌（谷氨酸棒状杆菌）（Brevibacterium lactofermentum(Corynebacteriumglutamicum))
[0062] 玫瑰色短杆菌（Brevibacteriumroseum)
[0063] 解糖短杆菌（Brevibacteriumsaccharolyticum)
[0064] 生硫短杆菌（Brevibacterium thiogenitalis)
[0065] 产氨棒状杆菌（停滞棒状杆菌）（Corynebacterium ammoniagenes(Corynebacteriumstationis))
[0066] 白色短杆菌（Brevibacterium album)
[0067] 錯状短杆菌（Brevibacterium cerinum)
[0068] 嗜氨微杆菌（Microbacteriumammoniaphilum)
[0069] 作为棒状杆菌型细菌，具体而言，可以举出如下所述的菌株。
[0070] 嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC13870
[0071] 醋谷氨酸棒状杆菌ATCC15806
[0072] 解烷棒状杆菌ATCC21511
[0073] 帚石南棒状杆菌ATCC 15991
[0074] 谷氨酸棒状杆菌ATCC13020,ATCC13032,ATCC13060，ATCC13869，FERMBP-734
[0075] 百合棒状杆菌ATCC15990
[0076] 栖糖蜜棒状杆菌ATCC17965
[0077] 有效棒状杆菌（热产氨棒状杆菌）AJ12340 (FERMBP-1539)
[0078] 力士棒状杆菌ATCC13868
[0079] 谷氨酸棒状杆菌（散枝短杆菌）ATCC14020
[0080] 谷氨酸棒状杆菌（黄色短杆菌）ATCC13826,ATCC14067,AJ12418(FERM BP-2205)
[0081] Immariophilum短杆菌ATCC14068
[0082] 谷氨酸棒状杆菌（乳酸发酵短杆菌）ATCC13869
[0083] 玫瑰色短杆菌ATCC13825
[0084] 解糖短杆菌ATCC14066
[0085] 生硫短杆菌ATCC19240
[0086] 产氨棒状杆菌（停滞棒状杆菌）ATCC6871，ATCC6872
[0087] 白色短杆菌ATCC 15111
[0088] 蜡状短杆菌ATCC 15112
[0089] 嗜氨微杆菌ATCC15354
[0090] 另外，棒状杆菌属细菌中也包含以往被分类为短杆菌属，但现在被统一为棒状杆 菌属的细菌（Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1991))。另外，停滞棒状杆菌中也包含以往 被分类为产氨棒状杆菌，但通过16SrRNA的碱基序列分析等而被再分类为停滞棒状杆菌的 细菌（Int.J.Syst.Evol.Microbiol.，60, 874-879 (2010)) 〇
[0091] 这些菌株例如可以由美国模式培养物保藏所（住所12301Parklawn Drive,Rockville,Maryland20852P.O.Box1549,Manassas,VA20108,UnitedStatesof America)接受出售。即，赋予有与各菌株对应的注册号，可以利用该注册号接受出售（参照 http://www.atcc.org/)。与各菌株对应的注册号记载在美国模式培养物保藏所的目录中。
[0092] 本发明的细菌可以为原本具有L-氨基酸生产能力的细菌，也可以为以具有L-氨 基酸生产能力的方式进行修饰而成的细菌。具有L-氨基酸生产能力的细菌例如可通过对 如上所述的细菌赋予L-氨基酸生产能力或通过增强如上所述的细菌的L-氨基酸生产能力 来获得。
[0093] L-氨基酸生产能力的赋予或增强可以利用以往棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细 菌等氨基酸生产菌的育种中所采用的方法来进行（参照氨基酸发酵、（株）学会出版中心、 1986年5月30日初版发行、第77~100页）。作为如上所述的方法，例如可以举出：营养 缺陷性突变株的获得、L-氨基酸的类似物抗性株的获得、代谢控制突变株的获得、L-氨基 酸的生物合成体系酶的活性得到增强的重组株的创造。在L-氨基酸生产菌的育种中，所赋 予的营养缺陷性、类似物抗性、代谢控制突变等性质可以为单独，也可以为2种或3种以上。 另外，在L-氨基酸生产菌的育种中，活性得到增强的L-氨基酸生物合成体系酶可以为单 独，也可以为2种或3种以上。进而，可以组合营养缺陷性、类似物抗性、代谢控制突变等性 质的赋予和生物合成体系酶的活性的增强。
[0094] 具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷性突变株、类似物抗性株、或代谢控制突变株 可通过将亲株或野生株供于通常的突变处理，从得到的突变株中选择显示营养缺陷性、类 似物抗性或代谢控制突变，且具有L-氨基酸生产能力的菌株来获得。作为通常的突变处 理，可以举出：X射线或紫外线的照射、利用N-甲基-N' -硝基-N-亚硝基胍（MNNG)、甲磺 酸乙酯（EMS)、甲磺酸甲酯（MMS)等突变剂的处理。
[0095] 另外，L-氨基酸生产能力的赋予或增强也可以通过增强参与目标L-氨基酸的生 物合成的酶的活性来进行。酶活性的增强例如可以通过以编码相同酶的基因的表达增强的 方式修饰细菌来进行。增强基因的表达的方法记载在W000/18935号小册子、欧洲专利申请 公开1010755号说明书等中。对增强酶活性的详细的方法进行后述。
[0096] 另外，L-氨基酸生产能力的赋予或增强也可以通过使催化从目标L-氨基酸的生 物合成途径中分支而生成目标L-氨基酸以外的化合物的反应的酶的活性降低来进行。另 外，在此所谓的"催化从目标L-氨基酸的生物合成途径中分支而生成目标L-氨基酸以外的 化合物的反应的酶"中也包含参与目标氨基酸的分解的酶。对使酶活性降低的方法进行后 述。
[0097] 以下，对L-氨基酸生产菌、及赋予或增强L-氨基酸生产能力的方法具体地进行例 示。另外，如以下例示那样的L-氨基酸生产菌所具有的性质及用于赋予或增强L-氨基酸 生产能力的修饰均可以单独使用，也可以适宜组合。
[0098] 〈L-谷氨酸生产菌〉
[0099] 作为L-谷氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，可以举出选自L-谷氨酸生物合成体 系酶中的1个或其以上的酶的活性得到增强的菌株。作为这样的酶，没有特别限制，可以举 出：谷氨酸脱氢酶（gdhA)、谷氨酰胺合成酶（glnA)、谷氨酸合成酶（gltBD)、异柠檬酸脱氢 酶（icdA)、乌头酸水合酶（acnA、acnB)、梓檬酸合酶（gltA)、甲基梓檬酸合酶（prpC)、磷酸 稀醇式丙酮酸羧化酶（ppc)、丙酮酸脱氢酶（aceEF，lpdA)、丙酮酸激酶（pykA，pykF)、磷酸 稀醇式丙酮酸合酶（PPsA)、稀醇酶（eno)、磷酸甘油变位酶（pgmA，pgmI)、磷酸甘油酸激酶 (pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gapA)、丙糖磷酸异构酶（tpiA)、果糖二磷酸醛缩酶（fbp)、 磷酸果糖激酶（pfkA，pfkB)、葡萄糖磷酸异构酶（pgi)、6-磷酸葡萄糖酸脱水酶（edd)、 2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶（eda)、转氢酶。需要说明的是，括弧内为编码其酶 的基因的缩写（以下的记载中也相同）。在这些酶中，优选增强例如选自谷氨酸脱氢酶、柠 檬酸合酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及甲基柠檬酸合酶中的1个或其以上的酶的活性。
[0100] 作为以谷氨酸合成酶基因（gltBD)的表达增大的方式进行修饰的棒状杆菌型细 菌，可以举出W099/07853中所公开的细菌。
[0101] 另外，作为L-谷氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，也可以举出选自催化从L-氨 基酸的生物合成途径中分支而生成L-氨基酸以外的化合物的反应的酶中的1个或其以上 的酶的活性降低或缺损的菌株。作为这样的酶，没有特别限制，可以举出：异柠檬酸裂合酶 (aceA)、a-酮戊二酸脱氢酶（sucA、odhA)、磷酸转乙酰酶（pta)、乙酸激酶（ack)、乙酰轻酸 合酶（ilvG)、乙酰乳酸合酶（ilvl)、甲酸乙酰转移酶（pfl)、乳酸脱氢酶（ldh)、谷氨酸脱羧 酶（gadAB)、琥珀酸脱氢酶（sdhAB⑶)、1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶（putA)。
[0102]a-酮戊二酸脱氢酶活性降低或缺损的棒状杆菌型细菌及它们的获得方法记载在TO2008/075483中。作为a-酮戊二酸脱氢酶活性降低或缺损的棒状杆菌型细菌，具体而 言，例如可以举出下述的菌株。
[0103] 乳酸发酵短杆菌L30-2菌株（日本特开2006-340603号说明书）
[0104] 乳酸发酵短杆菌AS菌株（国际公开95/34672号小册子）
[0105] 乳酸发酵短杆菌AJ12821 (FERMBP-4172 ;参照法国专利公报9401748号说明书）
[0106] 黄色短杆菌AJ12822(FERMBP-4173 ;法国专利公报9401748号说明书）
[0107] 谷氨酸棒状杆菌AJ12823(FERMBP-4174 ;法国专利公报9401748号说明书）
[0108] 谷氨酸棒状杆菌L30-2菌株（日本特开2006-340603号）
[0109] 另外，作为L-谷氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，也可以举出a-酮戊二酸 脱氢酶（sucA)活性及琥珀酸脱氢酶（sdh)活性两者均降低或缺损的菌株（日本特开 2010-041920号）。作为这样的菌株，具体而言，例如可以举出：谷氨酸棒状杆菌ATCC14067 的odhAsdhA双重缺损株（谷氨酸棒状杆菌8L3GASDH菌株）（日本特开2010-041920号）。
[0110] 另外，作为L-谷氨酸生产菌或用于衍生其的亲株，也可以举出已经以增强D-木 糖-5-磷酸-磷酸酮醇酶及/或果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶活性的方式进行修饰的菌株（日 本特表2008-509661)。可以增强D-木糖-5-磷酸-磷酸酮醇酶活性及果糖-6-磷酸磷 酸酮醇酶活性中的任一者，也可以增强两者。需要说明的是，在本说明书中，有时将D-木 糖-5-磷酸-磷酸酮醇酶和果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶统称为磷酸酮醇酶。
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