一种有机胺法选择性水解磷脂酰胆碱的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品领域，具体涉及一种有机胺法选择性水解磷脂酰胆碱的方法。
【背景技术】
[0002]磷脂是一种含有磷酸基类脂物质的总称，属于复合脂质。磷脂能与蛋白质、糖脂、胆固醇等其他分子细胞膜的结构构成磷脂双分子层，故磷脂是重要的营养物质。由于磷脂为两性分子，兼有亲水基团和亲油基团，可作为乳化剂等应用于食品领域。按磷脂的分子结构组成可将其分为甘油磷脂与神经鞘氨醇磷脂两大类，其中甘油磷脂是磷脂酸的衍生物，常见的有磷脂酰胆碱(PC，ph0Sphatidylch0line)、磷脂酰乙醇胺、磷酯酰丝氨酸，以及磷脂酰甘油等。
[0003]甘油磷脂酰胆碱(GPC, L-a-glycerylphosphorylcholine)是一种磷脂代谢的中间体，是磷脂酰胆碱分子上两个脂肪酰基完全水解的产物，同时是一种重要的神经递质。据报道，甘油磷脂酰胆碱在治疗帕金森疾病、脑部损伤、动脉硬化、类风湿以及老年记忆力衰退方面有重要的医药价值，对于维持和提高人体健康有重要作用。甘油磷脂酰胆碱在天然产物中的含量很少，主要存在于牛乳、花椰菜和卷心菜当中。
[0004]甘油磷脂酰胆碱最早是直接从牛的胰脏中萃取纯化得到的，这种原始的萃取方法不仅受限于材料，同时也限制了制备的规模，导致产品纯度不高，生产成本较高。随着科学技术的发展，国内外甘油磷脂酰胆碱的制备方法日趋成熟，主要有化学合成法、化学水解法、非水相酶法、沉淀法、重结晶法等，但是这些方法在不同程度上都有其局限性，比如制备过程复杂、成本较高、污染环境、得率低等。
[0005]中国发明专利申请公布号CN102875592A公开了一种天然L-α -甘油磷脂酰胆碱的制备方法。在该法中，磷脂在碱性条件下于低碳醇有机相(如甲醇)中发生醇解反应，生成L- α -甘油磷脂酰胆碱。该方法所需的碱性条件由氢氧化钠、氢氧化钾或者甲醇钠等强碱性物质提供。反应后使用由丙烯酸系打孔阳离子交换树脂制备的乙醇相树脂对产物进行吸附纯化。最终得到产物的总收率为60%?80%。该法因使用强碱进行反应，碱的用量需要严格控制，以防止副反应发生。同时由于其使用低碳醇作为溶剂，酯交换生成了相当数量的酯类副产物，且使用昂贵的离子交换树脂作为纯化手段，从而使得试剂消耗量较大，生产和提纯的成本$父尚。
[0006]中国发明专利CN103193821A公开了一种L-α -甘油磷酰胆碱的合成方法。该专利的关键步骤是卵磷脂在甲醇中通过碱金属醇盐催化剂(甲醇钠)脱去酰基。由于大量甲醇作为溶剂，此反应的实质是卵磷脂在碱性条件下与甲醇发生酯交换作用，生成了磷脂酰胆碱和对应的脂肪酸甲酯。因此，在反应完成后，该专利需要使用大量的有机溶剂(石油醚、丙酮)、有机或无机酸、树脂等进行萃取、吸附、结晶等提纯步骤，提高了生产和提纯的成本。
[0007]中国发明专利申请公布号CN102516292A公开了一种天然L-a -甘油磷脂酰胆碱及其制备方法。在此法中，非离子型有机胺(如三丁胺、二乙胺、丙胺、丁胺等)被用来引发卵磷脂与低碳醇(甲醇、乙醇、正丙醇等)的酯交换反应，将磷脂中脂肪酸在有机碱的催化下，和甲醇发生反应，生成脂肪酸甲酯和甘油磷脂酰胆碱；在此反应体系中，低碳醇是反应物，有机胺是催化剂，提供碱性环境。此法虽然较传统方法而言反应具有条件温和、时间短、产物纯度高等优点，但是由于低碳醇用量较大，需要回收利用，能耗比较大，使得生产和提纯的成本依然较高。
【发明内容】
[0008]为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种在水相反应体系下选择性水解磷脂酰胆碱中脂肪酸部分，高效制备甘油磷脂酰胆碱的方法。
[0009]为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案:
[0010]一种有机胺法选择性水解磷脂酰胆碱的方法，包括以下步骤:
[0011](I)向带有冷凝回流的反应装置中加入一定量的磷脂酰胆碱、水和甲醇，搅拌均匀并加热至反应温度；然后向反应体系中加入一定量的有机胺作提供弱碱性反应条件，引发磷脂酰胆碱的水解反应；反应一定时间后停止加热并冷却以停止反应；
[0012](2)将步骤(I)所得的产物进行纯化干燥以除去其中的部分有机胺、甲醇和水，得到含有甘油磷脂酰胆碱的产品。
[0013]步骤(I)所述磷脂酰胆碱为已纯化的磷脂酰胆碱产品或者是从大豆等原材料中提取的磷脂酰胆碱粗产品。
[0014]步骤(I)所述甲醇与水的体积比为1:1?1:8，磷脂酰胆碱的质量与甲醇的体积比为 1:1 ?1:4(w/V)ο
[0015]步骤(I)所述有机胺为二乙胺、异丙胺、正丁胺等简单有机胺，优选正丁胺。
[0016]步骤(I)所述有机胺与磷脂酰胆碱的摩尔比为1:1?5:1，优选2:1。
[0017]步骤(I)所述的水解反应温度为30?80°C，水解反应时间为I?24h。
[0018]步骤(2)所述产物的纯化干燥方法可以是减压蒸馏和冷冻干燥等能有效出去反应混合物中残留的有机胺、甲醇和水的方法。
[0019]与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果:
[0020](I)本发明提高甘油磷脂酰胆碱的得率，生产成本低廉、反应时间短、甘油磷脂酰胆碱产物易于提纯。
[0021](2)本发明使用水作为反应溶剂，对环境污染小。
【附图说明】
[0022]图1是本发明中磷脂酰胆碱在有机胺提供的碱性条件下水解为甘油磷脂酰胆碱的反应式。由于有机胺的用量两倍于磷脂酰胆碱，水解生成的脂肪酸将以其有机胺盐的形式存在于反应混合物中。
[0023]图2是实施例1制得的甘油磷脂酰胆碱的高效液相色谱图。图中甘油磷脂酰胆碱的保留时间为5.5min。
[0024]图3是实施例1制得的甘油磷脂酰胆碱的高效液相色谱检测标准曲线图。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0026]实施例1
[0027]称取0.5g的35%纯度的磷脂酰胆碱样品(按纯度记为PC35)，加入1mL圆底烧瓶中，并加入2mL甲醇和2mL蒸馏水；将烧瓶移入带磁力搅拌的油浴锅中，以600r/min的速度搅拌反应混合物，连接好冷凝回流装置并加热到70°C ;向反应混合物中加入正丁胺134 μ L引发反应(反应式如图1所示，由于有机胺的用量两倍于磷脂酰胆碱，水解生成的脂肪酸将以其有机胺盐的形式存在于反应混合物中。)，开始记录时间；反应6h后停止加热和搅拌，从油浴中移出烧瓶；待冷却至室温后取下烧瓶，使用旋转蒸发仪在抽真空条件下除去有机胺、甲醇和水，获得含有甘油磷脂酰胆碱的产品。
[0028]所得产品的分析检测方法为:将所得产品溶解于甲醇中，配成lmg/mL的溶液，通过高效液相色谱检测其中甘油磷脂酰胆碱的含量(如图2所示，图中甘油磷脂酰胆碱的保留时间为5.5min。)。检测条件为:采用岛津CBM-20A高效液相系统，AlltechSilica(4.6mmX250mm, 5μπι)色谱柱，柱温40 °C ;每次检测的进样量为1yL;甲醇为流动相，流速0.97mL/min ;检测器为蒸发光散射检测器:漂移管温度65°C，空气流速为2L/min。
[0029]样品的甘油磷脂酰胆碱含量通过标准曲线方程计算获得。标准曲线的制作方式为:将甘油磷脂酰胆碱标准品加入分析纯甲醇溶液中配制成浓度为0.0625,0.125,0.250、0.500、1.000mg/mL的系列标准溶液，通过前述高效液相色谱进行检测，以所得峰面积对数为纵坐标，浓度对数为横坐标，制作得到标准曲线(如图3所示)。
[0030]本发明中关于甘油磷脂酰胆碱(GPC)得率的计算方法为:
[0031 ] 用HPLC-ELSD测定样品中的GPC的量，使用以下公式计算GPC得率:
[0032]GPC(% ) = (Hi1Zm2) X 100%
[0033]其中=Hi1为反应过程中实际产生的GPC质量；m2为理论产生GPC的质量。
[0034]通过上述检测方法，得到甘油磷脂酰胆碱的得率为63.97%。
[0035]实施例2
[0036]称取0.5g的PC35样品，加入1mL圆底烧瓶中，并加入0.5m