从夏枯草中同时提取四种化合物的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中草药的提取领域，特别涉及一种夏枯草从夏枯草中同时提取四种化 合物的方法及应用。
【背景技术】
[0002] 夏枯草属为唇形科多年生草本植物，全球约有15种，广泛分布于欧亚的温带地区 及热带山区、非洲西北部及北美洲。自20世纪50年代起，日本、前苏联及中国学者就对夏 枯草属植物的化学成分进行了深入研究，迄今为止，从中分离得到的化合物主要为三萜及 其皂苷、酚酸、留醇及其苷、黄酮、香豆素、有机酸、挥发油及糖类等。
[0003] 夏枯草P. vulgaris L入药，一般是在夏季采取半干燥果穗入药，由于此草夏至后 即枯，故有此名。中医理论认为夏枯草味苦、辛，性寒，具有清火、明目、消肿、散结等功效，常 用于治疗目赤肿痛、目珠夜育，头痛眩晕，瘰疬，癭瘤，乳痈肿痛等。中国药典收载的以夏枯 草水煎剂而制成的中成药是夏枯草膏和夏枯草口服液，但目前以夏枯草膏改良的剂型有夏 枯草颗粒、夏枯草片、夏枯草胶囊等，均广泛用于中医临床，常用于治疗甲状腺肿大、淋巴结 核、乳腺增生、肺结核、急性黄疸型传染性肝炎、高血压等疾症。
[0004] 现代研究表明，夏枯草具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降压和降糖等活 性。近年来，以夏枯草为原料的中成药及保健产品相继问世，如夏桑菊颗粒、夏桑菊凉茶、王 老吉及加多宝等。
[0005] 尽管夏枯草作为药物使用已有悠久历史，在作用功效中明确有抗癌作用，但未 见报道从夏枯草中分离出来的天然产物：异迷迭香酸（trans-salviaflaside)、迷迭香酸 (rosmarinic acid)和它们的衍生物去用做抗乳腺癌治疗药物；同时也未见报道从夏枯 草中大量快速富集以及纯化异迷迭香酸（trans-salviaflaside)、迷迭香酸（rosmarinic acid)和它们的衍生物的方法。
[0006] 其中，异迷迭香酸苷、迷迭香酸、异迷迭香酸苷甲酯和迷迭香酸甲酯的结构分别如 下：
[0007]
【发明内容】
[0008] 本发明的第一目的是提供一种从夏枯草中同时提取四种化合物（异迷迭香酸苷、 迷迭香酸、异迷迭香酸苷甲酯、迷迭香酸甲酯）的方法。
[0009] 本发明的第二目的是提供一种通过混合异迷迭香酸苷、迷迭香酸、异迷迭香酸苷 甲酯、迷迭香酸甲酯得到的夏枯草提取物混合物。
[0010] 本发明的第三目的是提供夏枯草提取物混合物在抗肿瘤药物中的应用。
[0011] 为达到上述目的，具体采用如下的技术方案：
[0012] -种从夏枯草中同时提取异迷迭香酸苷、迷迭香酸、异迷迭香酸苷甲酯、迷迭香酸 甲酯的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0013] (1)、夏枯草经粉碎机粉碎，过筛，用甲醇回流提取，浓缩，得浓缩液1 ;
[0014] (2)将浓缩液1与硅胶1拌匀，得混合物1，混合物1用硅胶柱分离，流动相1采用 体积比均为10:1-20:1的乙酸乙酯-甲醇、二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇，得到两个部 位的洗脱液，部位1为乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷洗脱液，部位2为甲醇洗脱液；部位1 用所述流动相1洗脱到用TLC检测（浓硫酸一香兰素显色剂）没有明显的斑点为止；部位 2用甲醇洗脱到用TLC检测（浓硫酸一香兰素显色剂）没有明显的斑点为止；
[0015] (3)部位1所得洗脱液浓缩得浓缩液2,将浓缩液2与硅胶2拌匀，蒸干，得混合物 2 ;混合物2用硅胶柱分离，流动相采用体积比为10:1-20:1的二氯甲烷-甲醇，得到含迷迭 香酸与迷迭香酸甲酯部；
[0016] (4)含迷迭香酸和迷迭香酸甲酯部用反相C18柱分离，当流动相采用体积比为 3:10-2:5的甲醇-水时得迷迭香酸，当流动相采用体积比为2:5-3:5的甲醇-水时得迷迭 香酸甲酯；
[0017] (5)部位2所得洗脱液浓缩得浓缩液3,将浓缩液3与硅胶3拌匀，蒸干，得混合物 3 ;混合物3用硅胶柱分离，流动相采用体积比为15 :1 :1-15 :2 :1的乙酸乙酯：甲醇：水系 统，得到含异迷迭香酸苷与异迷迭香酸苷甲酯部；
[0018] (6)含异迷迭香酸苷和异迷迭香酸苷甲酯部用反相C18柱分离，当流动相采用体 积比为1:5-2:5的甲醇-水时得异迷迭香酸，当流动相采用体积比为2:5-3:5的甲醇-水 时得异迷迭香酸甲酯。
[0019] 在夏枯草提取物的制备方法中所述浓缩液指每IOml浓缩液中含样品量为3_5g。
[0020] 具体的，步骤（1)中夏枯草经粉碎机粉碎，过筛，用甲醇回流提取45-60min，夏枯 草与甲醇的用量比为1 :1〇 - I :8g/ml，优选地，夏枯草与甲醇的用量比为I :10g/ml。
[0021] 具体的，夏枯草经粉碎机粉粹，过20-60目筛，优选地，过40目筛。
[0022] 具体的，所述步骤（2)按1:1-1:3的重量比将浓缩液1与硅胶1拌匀，得混合物1 ; 步骤（3)按1:1-1:3的重量比将浓缩液2与硅胶2拌勾，在60-80°C的条件下蒸干，得混合 物2 ;步骤（5)按1:1-1:3的重量比将浓缩液3与硅胶3拌勾，在60-80°C的条件下蒸干，得 混合物3。
[0023] 优选地，步骤⑵中混合物1用硅胶柱分离，流动相采用体积比均为10:1-15:1的 乙酸乙酯-甲醇、二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇；更优选地，步骤（2)中混合物1用硅 胶柱分离，流动相采用体积比均为11:1的乙酸乙酯-甲醇、二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲 醇。
[0024] 优选地，步骤⑶中混合物2用硅胶柱分离，流动相采用体积比为10:1-15:1的二 氯甲烷-甲醇。
[0025] 步骤（3)的一种【具体实施方式】为：部位1所得洗脱液浓缩得浓缩液2,将浓缩液2 与硅胶2拌匀，蒸干，得混合物2 ;混合物2用硅胶柱分离，流动相采用体积比为11:1的二 氯甲烷-甲醇，得到含迷迭香酸与迷迭香酸甲酯部。
[0026] 步骤（4)的一种【具体实施方式】为：含迷迭香酸和迷迭香酸甲酯部用反相C18柱分 离，当流动相采用体积比为2:5的甲醇-水时得迷迭香酸，当流动相采用体积比为3:5的甲 醇-水时得迷迭香酸甲酯。
[0027] 步骤（5)的一种【具体实施方式】为：部位2所得洗脱液浓缩得浓缩液3,将浓缩液3 与硅胶3拌匀，蒸干，得混合物3 ;混合物3用硅胶柱分离，流动相采用体积比为15 :1 :1的 乙酸乙酯：甲醇：水系统，得到含异迷迭香酸苷与异迷迭香酸苷甲酯部。
[0028] 步骤（6)的一种【具体实施方式】为：含异迷迭香酸苷和异迷迭香酸苷甲酯部用反相 C18柱分离，当流动相采用体积比为1:5的甲醇-水时得异迷迭香酸，当流动相采用体积比 为3:5的甲醇-水时得异迷迭香酸甲酯。
[0029] 在本发明的技术方案中，步骤（2)中所述硅胶1和硅胶柱中的硅胶为60-100目； 步骤（3)所述硅胶2和步骤（5)所述硅胶3为100-200目，步骤（3)和步骤（5)中所述硅 胶柱中的硅胶为200-300目。
[0030] 本发明的提供的分离纯化方法，并且能从大批量的夏枯草中大量快速富集纯化四 种目标产物，具有步骤少、产率高、易操作的优点。本发明的提供的分离纯化过程包括粗分 与细分，样品在粗分时，分离快，所用时间短，成分交叉少且又不拖尾；在细分时，能减少分 离步骤，同时能得到高产量和高纯度的目标化合物。
[0031] 利用本发明的方法制备得到的异迷迭香酸苷、迷迭香酸、异迷迭香酸苷甲酯、迷迭 香酸甲酯具有产量大、纯度高（大于80% )，具有可工业化大量分离纯化特点。
[0032] 利用本发明的方法制备得到的异迷迭香酸苷、迷迭香酸、异迷迭香酸苷甲酯、迷迭 香酸甲酯还可以以甲醇-0. 5%冰乙酸水为流动相，利用反相C-18色谱柱进一步提纯，使其 纯度在95%以上。具体的提纯步骤为：将异迷迭香酸苷、迷迭香酸、异迷迭香酸苷甲酯、迷 迭香酸甲酯用甲醇溶解，分别制成浓度在〇.6g/ml的样品。样品用半制备高效液相色谱仪 制备。反相C-18色谱柱250X21. 2mm。每次进样量0.8ml/针，流动相采用甲醇-0.5%冰 乙酸水，流速l〇ml/min，检测波长254nm。梯度洗脱，0-5min，38%的甲醇：62%的0. 5%冰乙 酸水；5-2011^11，42%的甲醇：58%的0.5%冰乙酸水；20-301^11，52%的甲醇 ：48%的0.5% 冰乙酸水；目标化合物：异迷迭香酸苷出峰为14. 6min，迷迭香酸为17. 5min，异迷迭香酸苷 甲酯为21. 2min，迷迭香酸甲酯为25min。不同情况不同条件，但是更大的制备液相以及更 大的色谱柱会使工作效率大为提高。
[0033] 本发明的技术方案还包括利用本发明的方法得到的异迷迭香酸苷、迷