猪vip改良肽及其在大肠杆菌中的表达方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，涉及一种猪VIP改良肽及其在大肠杆菌中的表达 方法。
【背景技术】
[0002] 目前，在畜牧业生产中，抗生素的大量使用甚至滥用导致病原菌耐药性菌株甚至 超级细菌产生、抗生素在畜禽产品中残留以及随动物粪尿排出污染环境等一系列严峻问 题，严重影响了畜产品品质和人类健康。因此，研制安全、高效、不易产生耐药性的环保型防 病保健类畜禽用药物或添加剂来替代抗生素已迫在眉睫。动物体内存在的一类天然防御类 生物活性肽一抗菌肽因其具抗菌谱广、稳定性强、无毒副作用、无药残、不易产生耐药菌株 等系列优点，对其研究开发已成为探寻抗生素理想替代品的前沿性课题，被认为是新型抗 生素研究的新资源和重要途径。猪体内存在的天然活性肽VIP具有开发为防病保健类饲料 添加剂或兽用药品的优势和潜力：（1)结构简单明确：由28个氨基酸残基组成的直链肽；
[2] 具有多种生物学活性，而且活性较强：免疫调节、抗炎，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等 具有较强的抑杀作用；（3)作用浓度小：由于VIP属于内源性的激素类神经内分泌免疫调节 肽（脑肠肽），因此，以较小的作用浓度（miioL级）就能发挥较强的生物活性。VIP本身具 有的特性使它具有开发为高效、安全的防病保健类饲料添加剂和药物的潜力和广阔的应用 前景。
[0003] 然而，由于内源性的抗菌肽资源有限，直接分离纯化困难，化学合成肽类成本高， 而基因工程方法大量表达抗菌肽使之成为新兴饲料添加剂的途径更为现实，并显示出良好 前景。随着对抗菌肽构效关系和作用机制的阐明，以天然抗菌肽为模板，设计其改良肽，并 对其进行高效重组表达以开发抗生素替代品完全可行。利用基因工程方法获得抗菌肽的尝 试已在原核和真核体系获得成功，但异源高效表达抗菌肽仍面临多种困难，一是抗菌肽的 编码基因转录后的HiRNA较小，一般只有100~200bp，同时其表达的抗菌肽在表达细胞中 也容易被降解，很难实现抗菌肽的大量表达；二是抗菌肽具有抗菌作用，表达宿主，如细菌 或酵母细胞表达的抗菌肽会反馈性抑制宿主细胞活性，影响抗菌肽的进一步表达。由此可 见，如何进一步提高表达水平，在高表达的同时充分保持抗菌肽的生物学活性，提高基因表 达产物的稳定性，设计并表达抗菌活性更强、抗菌谱更广的抗菌肽等都是值得深入探究的 问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种猪VIP改良肽及其在大肠杆菌中的高效表达方法，以解 决现有肽抗菌活力不足和抗菌谱不广，以及现有生产技术流程复杂、生产成本高的问题。
[0005] 本发明所采用的第一种技术方案是，一种猪VIP改良肽，所述的猪VIP改良肽为如 下氨基酸序列：FTANYTRLRRQLAVRRYLAAILGRR。
[0006] 本发明所采用的第二种技术方案是，一种猪的VIP改良肽在大肠杆菌中的表达方 法，按照以下步骤实施：
[0007] 步骤1、猪VIP改良肽的基因的克隆：
[0008] 根据大肠杆菌密码子偏好性，由猪VIP改良肽的氨基酸序列推导获得猪VIP改良 肽的核苷酸序列为：
[0009] TTTACCGCAAATTATACCCGTCTGCGTCGTCAGCTGGCAGTTCGTCGTTATCTGGCAGCAATTCTGGGT CGTCGT ；
[0010] 为避免改良肽对大肠杆菌宿主菌的毒性，将TrxA与PVIPni进行融合表达，设计目 的基因的核苷酸序列为113bp，具体序列为：
[0012] 其中，方框标示的部分分别为XhoI和KpnI酶切位点；下划线标识的部分为肠激酶 识别序列；TAA为终止密码子；黑体倾斜部分为PVIP ni基因序列；
[0013] 为了获得所述目的基因，设计合成了三条引物PI、P2和P3，具体为：
[0017] 其中，所述引物序列Pl和引物序列P2中的方框分别表示XhoI和KpnI酶切位点， 引物扩增长度为113bp，经PCR扩增后，对得到的目的基因进行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴 定，说明已成功克隆了猪VIP改良肽基因；
[0018] 步骤2、猪VIP改良肽重组大肠杆菌表达载体的构建和鉴定：
[0019] 对扩增获得的猪VIP改良肽基因和pET32a(+)分别同时进行双酶切，然后将猪 VIP改良肽基因与pET32a(+)进行连接，以将其构建到表达载体上，获得的重组质粒可编码 TrxA-PVIPni融合蛋白；同样转化DH5a感受态细胞，挑取单菌落培养后经测序进行鉴定，说 明猪VIP改良肽的表达载体构建成功；
[0020] 步骤3、猪VIP改良肽对大肠杆菌感受态细胞的转化及诱导表达：
[0021] 将所述的重组质粒PETSS-PVIPni转化E. coliBL21 (DE3)感受态细胞，得到 PET32-PVIP/BL21 (DE3)重组菌；将重组菌接种于氨苄含量为100 μ g/mL的LB培养基中培 养，诱导表达后得到菌液，对菌液进行表达量检测；
[0022] 步骤4、融合蛋白的纯化：
[0023] 使用Ni-NTA亲和层析纯化超声上清中的融合蛋白，依次用含有不同浓度咪唑的 PBS缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，用S印hadex G25对Ni-NTA纯化所得融合蛋白进行脱盐， 使用超滤管对产物进行浓缩，即可得到纯化后的融合蛋白TrxA-PVIP ni;
[0024] 步骤5、猪VIP改良肽的释放：
[0025] 用人工引入的肠激酶切割位点切割融合蛋白TrxA-PVIPni，去除担体蛋白，释放目 标抗菌肽；将步骤4中纯化浓缩的融合蛋白PVIP ni用肠激酶进行酶切，即成功释放重组表达 ρν?Ρη〇
[0026] 进一步的，步骤I中的猪VIP改良肽基因的PCR反应体系为：ddH20 20 yL， IOXBuffer 含 Mg2+5yL，dNTP 2.5mM 4yL，引物 Ρ15μΜ 10yL，引物 Ρ25μΜ 0.5yL，弓 I 物 P35 μ M 10 μ L，pfu 0· 5 μ L ;PCR 反应条件如下：94°C预变性 5min ;94°C 30s，60°C 40s， 72°C Imin进行30个循环；72°C延伸5min ;4°C保存。
[0027] 进一步的，步骤2中猪VIP改良肽重组大肠杆菌表达载体的构建方法为：用双酶切 连接法构建重组质粒pET32-pVIPJ寸，按外源基因与质粒摩尔数比为3 :1的比例进行混合， 反应体系为10uL，16°C过夜。
[0028] 进一步的，步骤2中转化DH5a感受态细胞的方法为：将10 μ L的连接产物加入到 感受态细胞中，冰浴30min ;42°C水浴60s，快速移至冰水浴中放置2min，加入500uL LB， 37°C 180rpm培养Ih ;取部分菌液涂布于LB平板，所述LB平板含有浓度为100 μ g/mL的氨 苄；37°C倒置培养12~16h，观察单菌落，如果有阳性克隆菌并经测序进行鉴定，说明猪VIP 改良肽的表达载体构建成功。
[0029] 进一步的，连接产物的制备方法为：将连接缓冲液1 μ L，无菌水2 μ L，T4连接酶 1 μ L，双酶切后割胶回收的ρΕΤ32质粒2 μ L，双酶切后割胶回收的PCR产物4 μ L混合后， 16°C反应16h，得到连接产物。
[0030] 进一步的，步骤3中诱导表达的具体方法为，将重组菌接种于氨苄含量为100 μ g/ mL的LB培养基中，于37°C 180rpm培养16~24h，按1 %的接种量转接于新鲜的氨苄含量 为100 μ g/mL的LB培养基中，37°C 180rpm振荡培养至OD6。。约0. 6时，加入终浓度0. 4mM的 IPTG，诱导4h，得到菌液。
[0031] 进一步的，步骤3中对菌液表达量检测的具体方法为：将诱导表达菌液14000~ 15000rpm 4°C离心10min，弃上清，向菌体中加入5mL pH 8. 0的磷酸钠缓冲液，重悬，冰浴 中超声破碎；4°C，14000~15000r pm离心15min，收集超声上清液；取一定量加入相应上样 缓冲液煮沸，使用15 % SDS-PAGE检测蛋白表达情况，并用Bradford法测定超声上清中总蛋 白含量，使用Quantity One扫描SDS-PAGE凝胶，计算目的蛋白占总蛋白的含量。
[0032] 进一步的，步骤4中PBS缓冲液的组成为20mM PBS，0. 5M N