小反刍兽疫病毒n蛋白单克隆抗体、含有该抗体的试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物病毒检测技术领域，具体涉及小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗 体、含有该抗体的试纸条及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 小反会兽疫（Peste des petits ruminants，PPR)又名小反会兽假性牛痕、肺肠 炎、口炎肺肠炎复合症，是由小反会兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV) 引起的急性、烈性传染病。世界动物卫生组织（OIE)将PPR列为必须上报的动物疫病，我国 农业部将PPR列为一类动物疫病。PPR严重影响反刍动物养殖业的健康发展及相关动物和 动物产品的国际贸易，对疫区造成巨大的经济损失。PPR具有患病率、死亡率高的特点，易 感动物主要是山羊和绵羊，野生的小反刍动物亦可感染发病致死亡。该病在临床上的主要 特征是发热、坏死性口炎、流涎、腹泻和肺炎。自PPR首次于1942年在科特迪瓦爆发以来， 在撒哈拉以南和赤道以北的多数非洲国家、中东到土耳其的几乎全部国家都有传播。2007， 该病首次在我国西藏阿里地区爆发，随后几年内，该病在西藏部分地区仍有发病，对西藏动 物养殖业造成巨大的经济损失。2013年12月，小反刍兽疫在国内新疆、西藏、内蒙古、宁夏 等20多个省、自治区爆发，造成大量的反刍动物发病、死亡，并且对该病的控制带了巨大的 挑战。
[0003] 目前，检测PPRV的方法主要为病毒分离、RT-PCR和荧光RT-PCR，这些方法操作繁 琐、费时。RT-PCR和荧光RT-PCR方法虽然特异性和敏感性都很高，但需要专门的仪器设备 和技术人员，只能用于实验室检测。这些方法均不适用于现场检测、快速检测和基层兽医部 门临床检测。现有的针对动物病毒检测方法包括荧光免疫层析检测的方法，荧光免疫层析 技术，是免疫焚光技术（Immunofluorescence technique)和传统免疫层析技术相结合发展 创新的一种定量新型检测技术。免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤维层析材 料为固定相，测试液为流动相，通过毛细作用使待测物在层析条上移动，待测物在T线处发 生特异性免疫反应。游离物在C线处发生免疫反应。该技术在保留胶体金免疫层析技术操 作简便、检测快速、便携性强的优点外，还通过荧光示踪增强技术实现了检测结果的精确定 量。
[0004] 由此可见，对于本领域技术人员能否针对小反刍兽疫病毒建立PPRV荧光免疫层 析检测试纸，可用于PPRV的快速检测和现场检测，有利于对感染PPRV流行病学的调查，从 而为PPR的预防和控制提供科学的依据，有利于动物养殖业的健康发展，成为本领域技术 人员亟待解决的技术难题。
【发明内容】
[0005] 本发明为了解决上述技术问题，提供一种小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体、小 反刍兽疫病毒荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法。用荧光微球标记的小反刍兽疫病毒 特异性单克隆抗体、多克隆抗体、硝酸纤维素膜等为主要材料，建立小反刍兽疫病毒荧光免 疫层析试纸检测试纸条，可以用于PPRV的快速检测和现场检测，解决目前国内缺乏PPRV快 速检测和现场检测方法和检测工具的现状。
[0006] 为了达到上述技术效果，本发明的技术方案包括：
[0007] -种小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体，所述的小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗 体，由小反刍兽疫病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株117-6H6产生，小反刍兽疫病毒单克隆抗 体杂交瘤细胞株117-6H6保藏编号为CCTCC NO. C2014233,于2014年12月3日保藏在中国 典型培养物保藏中心，其存活性于2014年12月10检测完毕，结果为存活。
[0008] -种上述小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：用纯化 的小反刍兽疫病毒免疫小鼠，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，分别 用纯化的小反刍兽疫病毒抗原、基因工程表达的小反刍兽疫病毒N蛋白和BHK细胞建立 间接ELISA检测细胞培养上清，3种ELISA方法分别命名为：PPRV-ELISA、PPRV N-ELISA 和BHK-ELISA，筛选PPRV-ELISA和PPRV N-ELISA检测为阳性，且BHK-ELISA检测为阴性 的细胞孔，确定为可以分泌小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体的阳性克隆，建立可稳定分 泌小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为：117-6H6,并将该细胞株 送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏时间为2014年12月3日，编号为：CCTCC NO.C2014233。
[0009] -种小反会兽疫病毒焚光免疫层析检测试纸条，包括背衬、样品垫、焚光微球标记 的小反刍兽疫病毒单克隆抗体复合物垫、已点样检测线和对照线的硝酸纤维膜、吸水垫， 所述检测线包被有羊抗小反刍兽疫病毒多克隆抗体，所述对照线包被有葡萄球菌A蛋白， 所述的小反刍兽疫病毒单克隆抗体为小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体，由小反刍兽疫 病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株117-6H6产生，所述小反刍兽疫病毒单克隆抗体杂交瘤细 胞株117-6H6于2014年12月3日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.C2014233。
[0010] 所述的羊抗小反刍兽疫病毒多克隆抗体浓度为I. 5mg/mL，所述的葡萄球菌A蛋白 浓度为lmg/mL。
[0011] 所述的羊抗小反刍兽疫病毒多克隆抗体包被量为〇. 3375 μ g/条，所述的葡萄球 菌A蛋白包被量为0. 225 μ g/条。
[0012] -种小反刍兽疫病毒荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
[0013] 步骤一：小反会兽疫N蛋白单克隆抗体的制备：用纯化的小反会兽疫病毒免疫8 周龄BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，分别用纯化的小 反刍兽疫病毒抗原、基因工程表达的小反刍兽疫病毒N蛋白和BHK细胞建立间接ELISA检 测细胞培养上清，3种ELISA方法分别命名为：PPRV-ELISA、PPRV N-ELISA和BHK-ELISA，筛 选PPRV-ELISA和PPRV N-ELISA检测为阳性，且BHK-ELISA检测为阴性的细胞孔，确定为可 以分泌小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体的阳性克隆，建立可稳定分泌小反刍兽疫病毒N 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为：117-6H6,并将该细胞株送至中国典型培养物保 藏中心进行保藏，保藏时间为2014年12月3日，编号为：CCTCC NO. C2014233 ;
[0014] 步骤二：荧光微球标记小反刍兽疫病毒单克隆抗体的制备：采用EDC介导法将步 骤一所制备的小反刍兽疫病毒单克隆抗体和荧光微球进行偶联；
[0015] 步骤三：羊抗小反刍兽疫病毒多克隆抗体的制备：用纯化的小反刍兽疫病毒免疫 绵羊，经耳静脉采血并分离血清，用PPRV-ELISA检测抗体效价，若效价达到1 : 5000以上， 通过颈动脉放血，分离血清，灭活后用A/G抗体纯化柱对多克隆抗体进行纯化，用PBS稀释 至 L 5mg/mL ;
[0016] 步骤四：检测线和对照线的制备：首先将硝酸纤维素膜粘贴于背衬表面，再将步 骤三制备的浓度为I. 5mg/mL的羊抗小反会兽疫病毒多克隆抗体和浓度为lmg/mL的葡萄球 菌A蛋白分别点在硝酸纤维膜上，作为检测线和对照线试剂；
[0017] 步骤五：试纸条的组装和切割：将背衬和已点样检测线和对照线的硝酸纤维膜、 荧光微球标记的小反刍兽疫病毒单克隆抗体复合物垫、样品垫、吸水垫粘在一起，并于 CM4000切条机中，将其切成3mm宽的试纸条，干燥保存备用。
[0018] 所述步骤二的偶联方式，具体操作为：向5mL pH 5. 0的0. 02mol/L PBS溶液