一株具高抗氧化活性的植物乳杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及一株具高抗氧化活性的植物乳杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 生物氧化是机体新陈代谢的重要生理过程，但此过程中会产生自由基等各种活性 氧分子（ROS)。尽管正常情况下，机体存在着自由基清除系统，但如果机体受到某些因素影 响，自由基清除系统出现故障导致体内自由基过度产生，则会作用于机体内的蛋白质、核酸 等分子，造成细胞损伤，给机体健康带来很大威胁。通过膳食中补充抗氧化物质可以增强机 体的抗氧化能力，但许多化学合成的抗氧化剂存在安全问题。乳酸菌作为肠道常驻菌群，可 以直接在机体氧化损伤的重点部位-肠道发挥抗氧化作用，维持肠道处于氧化还原平衡状 态。并且乳酸菌在肠道定植后还能不断增殖，产生更多能够发挥抗氧化作用的乳酸菌，源源 不断地在肠道扮演ROS清道夫的角色。因此乳酸菌的抗氧化作用与传统的抗氧化剂相比有 更多的优势。
[0003] 近些年许多体外和体内实验已证明一些乳酸菌具有良好的抗氧化活性，Li等对分 离自中国传统发酵食物中的11株植物乳杆菌体内外抗氧化能力进行了研究，发现植物乳 杆菌C88乳酸菌的抗氧化活性已经得到体内及体外试验的证实。能较好地缓解D-半乳糖 诱导的小鼠氧化应激；Kullisaar等利用人体实验表明发酵乳杆菌ME-3具有抗氧化活性。
[0004] 本研究从市售泡菜中分离得到的7株菌并对其进行抗氧化性能筛选，筛选到一株 具强抗氧化性能的植物乳杆菌，分析其抗氧化机理，并对其耐受性进行研究，为将乳酸菌的 抗氧化作用应用于功能性食品或保健品的开发和生产提供理论依据。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一是筛选出一株高抗氧化活性植物乳杆菌，分析其抗氧化机理， 并对其耐受性进行研究，为将该菌的抗氧化作用应用于功能性食品或保健品的开发和生产 奠定基础。
[0006] 本发明提供一株具高抗氧化活性的植物乳杆菌，该菌命名为植物乳杆菌 BLCC2-0015 (Lactobacillus plantarum BLCC2-0015)，保藏编号为 CCTCC N0:M2015126,保 藏日期为2015年3月18日，保藏于中国武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心。
[0007] 本发明还提供一种上述植物乳杆菌BLCC2-0015,在制备用于机体抗氧化的食品或 保健品中的应用。
[0008] 本发明再提供一种用于机体抗氧化的食品或保健品，其特征在于，包括上述植物 乳杆菌 BLCC2-0015。
[0009] 进一步的，将所述植物乳杆菌BLCC2-0015制备成菌粉与载体混匀即可。
[0010] 进一步的，所述菌粉通过以下步骤得到的：
[0011] 取植物乳杆菌BLCC2-0015冻干粉菌种；
[0012] 将所述冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上活化；
[0013] 取活化后的固体斜面培养基，在无菌条件下接种于种子液体培养基中，培养得到 一级种子液；
[0014] 将所述一级种子液接种于另一种子液体培养基中，培养得到二级种子液；
[0015] 将所述二级种子液接种于液体发酵培养基中发酵；
[0016] 待所述液体发酵培养基中发酵液黏度达12000-15000cP时，收集发酵液；
[0017] 将所述发酵液干燥得到菌粉成品。
[0018] 进一步的，所述发酵液干燥得到菌粉成品的步骤为将所述发酵液离心并用清水清 洗，如此重复2-3遍后冷冻干燥，粉碎，即为菌粉成品；或发酵结束后，将所述发酵液立即喷 雾干燥，得菌粉成品。
[0019] 进一步的，所述种子液体培养基包括：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L 和酵母膏5g/L，调节pH至5. 5-6. 5,115°C条件下灭菌20min ;所述得到一级种子液和所述 得到二级种子液的培养条件均为30-37°C静置培养12-16h。
[0020] 进一步的，所述固体斜面培养基为所述种子液体培养基中添加1. 5-2. 0%的琼脂 粉；菌种活化条件为30-37°C培养20-30h。
[0021] 进一步的，所述液体发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏IOg/ U酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0. 5g/L、硫酸锰 0. 2g/L和吐温-801mL/L，使用时，调节pH至5. 5-6. 5 ;所述发酵条件为30-37°C条件下，静 置培养10-24h。
[0022] 进一步的，所述一级种子液和二级种子液的接种量均为1-5%。
[0023] 本发明的有益效果在于：本发明的具高抗氧化活性的植物乳杆菌从众多乳酸菌中 筛选得到的，不仅具高抗氧化活性，还可以具有良好的耐酸耐胆盐特性。将该菌菌粉制成机 体抗氧化食品或保健品，直接食用或冲服饮用，使用方便，可增强机体免疫力。
[0024] 本发明提供的可用于抗氧化的乳杆菌命名为植物乳杆菌 BLCC2-0015 (Lactobacillus plantarum BLCC2-0015)，已于 2015 年 3 月 25 日保藏于中国 典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC N0:M2015126。
【附图说明】
[0025] 图1为本发明植物乳杆菌BLCC2-0015的生长曲线；
[0026] 图2为菌株BLCC2-0015的菌体形态（油镜观察）；
[0027] 图3为菌株BLCC2-0015PCR扩增产物琼脂凝胶电泳结果；
[0028] 图4为菌株BLCC2-0015的系统进化分析；
[0029] 图5为菌株BLCC2-0015对胆盐耐受性结果。
【具体实施方式】
[0030] 下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中 描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达 到更好的技术效果。
[0031] 实施例1
[0032] 1、乳酸菌的分离纯化
[0033] 取适量泡菜至80mL MRS培养基中37°C富集培养20h，取培养液于含0&〇)3的MRS 琼脂培养基上划线，37°C恒温静止培养24h后，挑取培养基上具有明显透明圈的单菌落，经 革兰氏染色和接触酶反应，挑出革兰氏染色阳性、接触酶阴性菌株斜面保存。
[0034] 2、具有抗氧化活性乳酸菌的筛选
[0035] 2. 1乳酸菌的培养及发酵液的制备
[0036] 乳酸菌在MRS液体培养基中37°C培养24h，6000r/min，4°C离心10min，收集上清液 即为发酵液。
[0037] 2. 2乳酸菌在不同浓度H2O2溶液中的耐受能力测定
[0038] 在IOOmL灭菌的三角瓶中加入60mL的MRS液体培养基，分别添加过氧化氧溶液， 使培养基中的起始H2O2浓度分别为0. 4mmol/L、0. 7mmol/L和1.0 mmol/L，并按1 %的接种 量接入分离所得的菌株培养液，置于37°C恒温培养箱中培养24h，取样测定值，观察每株菌 在不同起始过氧化氢浓度下的生长趋势，挑选具有过氧化氢耐受性较高的菌株进行后续实 验。
[0039] 2. 3 DPPH清除率的测定
[0040] 2mL DPPH自由基甲醇溶液（0. 2mmol/L)中，加入2mL发酵液，室温避光条件下反应 30min后，3000rpm离心10min，收集上清液于517nm测吸光度，以纯净水替代乳酸菌发酵液 反应液作为空白对照，以纯净水与甲醇1:1比例混合液调零。
[0041] DPPH 自由基清除率=[1-A517(样品）/A517(空白）]X100%
[0042] 2. 4羟自由基· OH清除率的测定
[0043] ImL 的 PBS (pH = 7. 4)中加入 ImL 邻菲罗啉（2. 5mmol/L)、ImL FeSO4 (2. 5mmol/L)、 H2O2 (浓度为20mmol/L)，再加入0. 5mL样品，37°C恒温水浴反应I. 5h后，在536nm处测吸光 值。
[0044] 清除率（％ ) = [ (A2-A1) AA0-A1) ] X 100 %
[0045] 注：A。为不含样品和H 202;A i为不含样品