一株利用精氨酸且不积累瓜氨酸的解淀粉芽孢杆菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株利用精氨酸且不积累瓜氨酸的解淀粉芽孢杆菌，属于微生物领 域。
【背景技术】
[0002] 氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate, EC)是一种致癌物质，被人体持续过量摄入可能 会引发肺癌、肝癌等严重性肿瘤疾病，并且对人体的免疫系统造成伤害。研究发现，氨基甲 酸乙酯广泛存在于各种酒类饮料和发酵食品中，酱油是一种发酵食品，在市场上的各种酱 油产品尤其是日式酱油中，均不同程度的检测到氨基甲酸乙酯的存在。
[0003] 酿造酱油中氨基甲酸乙酯的主要前体物质是瓜氨酸与乙醇。因此降低酱油中瓜氨 酸的含量是我们降低酱油中氨基甲酸乙酯有效措施之一。
[0004] 在酱油生产前期，原料水解出大量精氨酸，这些精氨酸在一大类厌氧或兼性厌氧 的乳酸菌的作用下，被转化为瓜氨酸。如果这些精氨酸被一些具有完整精氨酸脱亚氨基途 径的菌株利用，将精氨酸转化成鸟氨酸，就能降低酱油中的瓜氨酸积累。
[0005] 本发明目的在于发现一株能耐高盐的解淀粉芽孢杆菌，能在高盐条件下高效利用 精氨酸转化成鸟氨酸而不积累瓜氨酸，从而降低酱油中氨基甲酸乙酯的含量。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)BBE_JY06， 该菌已于2015年7月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2015423，保藏地址为中国武汉武汉大学。
[0007] 所述解淀粉芽孢杆菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。该菌在180g/ LNaCl的高盐环境下能利用精氨酸且不积累瓜氨酸。
[0008] 所述解淀粉芽孢杆菌分离自日式工艺的酱醪，其分离方法如下：在分离平板上涂 布少许酱醪稀释液，30°C培养5天，观察菌落形态，挑取菌落周围紫红色显色圈最大的菌 落进一步分离纯化后得到。所述分离平板是含l〇g/L精氨酸、0.06g/L溴甲酚紫的氨基 酸检测培养基；所述氨基酸检测培养基含有：酵母膏5g/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨5g/L， NaCl 180g/L，葡萄糖 0· 5g/L，Tween-801g/L，MgSO4 · 7H20 0· 2g/L，MnSO4 · H2O 0· 05g/L， FeSO4O. 4g/L，柠檬酸三胺 2g/L，CaC030· lg/L，吡哆醛-5-磷酸(λ 05g/L，K2HP042g/L，pH 5. 3。
[0009] 所述解淀粉芽孢杆菌的保藏条件如下：从生长良好的平板上挑取单菌落转接入含 100g/L NaCl的LB培养基中，在30°C静置培养36小时，取500 μ L培养液移入含有500 μ L 30%甘油的保藏管中，置于-80°C冰箱保存。
[0010] 所述解淀粉芽孢杆菌的培养条件为：将保藏的解淀粉芽孢杆菌在含100g/L NaCl 的LB固体培养基上划线，于30°C静置培养两天，挑取单菌落接入含100g/LNaCl的LB液体 培养基，30°C静置培养36小时。将培养物离心lmin(8000rpm，4°C )后去上清获得菌体，用 1/5体积磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.0)重悬浮菌体，获得菌悬液。
[0011] 向5mL离心管中加入4mL含lOg/L精氨酸的氨基酸检测培养基，接种500 μ L的菌 悬液，接种后的OD6。。为7. 8。因为精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸的变化量在第3天达到最大，因此 3〇°C静置培养3天后用HPLC的方法检测培养基中精氨酸、瓜氨酸以及鸟氨酸含量，结果表 明精氨酸含量以及瓜氨酸含量为〇,鸟氨酸大量积累。因此，在高盐条件下这株解淀粉芽孢 杆菌能利用精氨酸并不积累瓜氨酸。
[0012] 本发明提供的解淀粉芽孢杆菌能在高盐条件下利用环境中的精氨酸，既消耗掉瓜 氨酸的前体物又不积累瓜氨酸，从而能避免酱油发酵过程中瓜氨酸的积累，最终达到降低 环境氨基甲酸乙酯的含量的目的。
[0013] 生物材料保藏
[0014] 解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens) BBE-JY06,已于 2015 年 7 月 2 日 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2015423,保藏地址为中国武汉 武汉大学。
【具体实施方式】
[0015] 分离平板：含10g/L精氨酸、0.06g/L溴甲酚紫的氨基酸检测培养基。培养条件： 30°C培养5天。
[0016] 基因组提取试剂盒：E.Z.N. A Bacterial DNA Kit D3350-01。
[0017] 氨基酸检测培养基：酵母膏5g/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨5g/L，NaCl 180g/L，葡萄 糖 0· 5g/L，Tween-801g/L，MgSO4 · 7H20 0· 2g/L，MnSO4 · H2O 0· 05g/L，FeSO4O. 4g/L，柠檬酸 三胺2g/L，CaC030. lg/L，吡哆醛-5-磷酸0.05g/L，K2HP042g/L，pH 6.0。用于检测特定氨基 酸时，添加氨基酸l〇g/L。
[0018] 解淀粉芽孢杆菌的培养条件为：将保藏的解淀粉芽孢杆菌在含100g/L NaCl的LB 固体培养基上划线，于30°C静置培养2天，挑取单菌落接入含100g/L NaCl的LB液体培养 基，30°C静置培养36小时，离心Imin (8000rpm，4°C )后去上清，所获得菌体的用磷酸盐缓冲 液（PBS，ρΗ7· 0)重悬浮。
[0019] 实施例1解淀粉芽孢杆菌筛选方法
[0020] 从第21天的日式酱油工艺酱醪中取样稀释涂板到解淀粉芽孢杆菌分离培养基平 板上，30°C富集培养5天。挑选表面粗糙、不透明、有隆起、边缘不规则、周围紫红色圈最大 的单菌落接种到含有l〇〇g/L NaCl的LB固体培养基上，划线分离作纯培养。两天后，将纯培 养物接种到l〇〇g/LNaCl的LB液体培养基中培养36小时富集菌体，提取基因组。通过16S rDNA测序结果与数据库比对后确定是解淀粉芽孢杆菌。该菌已于2015年7月2日保藏于 中国典型微生物菌种保藏管理中心，武汉市武昌珞珈山，保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2015423， 其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0021] 实施例2解淀粉芽孢杆菌利用精氨酸能力分析
[0022] 挑取平板上活化好的解淀粉芽孢杆菌单菌落接种于100g/L NaCl的LB液体培养 基中，30°C静置培养36小时，取5mL菌液离心lmin(8000rpm，4°C )弃上清，所获菌体加入 ImL磷酸盐缓冲液（PBS，ρΗ7· 0)重悬浮。
[0023] 向5mL离心管中加入4mL含10g/L的精氨酸的氨基酸检测培养基，接种500 μ L的 悬浮菌液，接种后OD6。。为7. 8。30°C静置培养3天后用HPLC的方法检测培养基中精氨酸和 瓜氨酸以及鸟氨酸含量，结果表明精氨酸含量降到0,瓜氨酸积累量为0,鸟氨酸大量积累。 因此，在高盐条件下这株解淀粉芽孢杆菌利用精氨酸转化为鸟氨酸，不积累瓜氨酸。具体数 值如下：
[0024] 表1不同盐浓度下精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸代谢变化
[0026] AArg(g/L):精氨酸的消耗量Δ Cit (g/L):瓜氨酸的生成量 A〇rn(g/L):鸟氨 酸的生成量
[0027] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一株解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)BBE-JY06,于 2015 年 7 月 2 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:M 2015423,保藏地址为中国武 汉武汉大学。2. 权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌在酿造调味品中的应用。3. 权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌在酿造酱油中的应用。4. 权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌在降低食品氨基甲酸乙酯含量中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一株利用精氨酸且不积累瓜氨酸的解淀粉芽孢杆菌，属于微生物领域。所述解淀粉芽孢杆菌，已于2015年7月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？NO:M？2015423，保藏地址为中国武汉武汉大学。这株解淀粉芽孢杆菌能够在高盐条件下利用精氨酸转化成鸟氨酸，并且不积累瓜氨酸。CCTCC NO: M 201542320150702
【IPC分类】C12P13/10, C12R1/07, A23L1/238, A23L1/23, C12N1/20
【公开号】CN105018381
【申请号】CN201510439604
【发明人】方芳, 张继冉, 胡传旺, 陈坚, 堵国成
【申请人】江南大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月23日