一种产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化合物生物技术生产领域，尤其是一种产生四氢嘧啶的基因工程菌及 其构建方法与应用。
【背景技术】
[0002] 目前四氢嘧啶的生产方法包括发酵法和酶催化法。其中，
[0003] 嗜盐微生物中具有四氢嘧啶的合成途径，因此广泛应用于四氢嘧啶的发酵法生产 中。Sauer T等采用"细菌挤奶法"高密度发酵获得了较高产量的四氢嘧啶，即高渗透压下 培养细菌、然后低渗冲击释放溶质、再将菌体重新高渗培养、低渗冲击释放溶质，依次循环 多至8-9次，获得产物。朱皖宜（201310416404. 4)等公开了一种可用于生产四氢嘧啶的新 的盐单胞菌Halomonas sp. HS-2255及其突变株，保藏号为CGMCCNo. 6248。该菌株在含有可 同化的碳源和氮源且较低的NaCl含量的培养基中具有较高的四氢嘧啶产量，并且副产物 羟基四氢嘧啶的含量较低。
[0004] 酶催化法是通过在大肠杆菌中表达四氢嘧啶合成基因簇ectABC以获得具有相 应酶活性的全细胞或粗酶液，以天冬氨酸为前体物催化合成四氢嘧啶的过程。董志扬 等（201310518176. 1,201310534045. 2)采用利用 E.coli BW-pBAD-ectABC，保藏编号为 CGMCCNO. 8334,将L-天冬氨酸钠经生物转化反应后即得。该菌体重复使用五次每升发酵菌 体共可以合成胞外四氢嘧啶87. 5g，合成效率达到11. 67g/L. d。
[0005] 以上两种方法中，嗜盐菌发酵生产四氢嘧啶的不足在于培养过程中均需要高的 NaCl浓度来刺激菌体积累更多的产物，发酵周期较长，而且高浓度的NaCl溶液对发酵设备 腐蚀严重，不适合大规模的工业化生产，同时高盐的发酵废液对环境造成了较大压力；酶催 化法生产四氢嘧啶的底物为天冬氨酸钠，酶需要诱导表达并提取，因此操作比较复杂，生产 成本较高。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种产生四氢嘧啶的基因工程菌。
[0007] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述产生四氢嘧啶的基因工程菌的构 建方法。
[0008] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述产生四氢嘧啶的基因工程菌的应 用，用于制备四氢嘧啶。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0010] 一种产生四氢嘧啶的基因工程菌（E. coliECT06)，为具有特定基因型的大肠杆菌， 包含来源于伸长盐单胞菌ectABC基因；lysA、thrA、iclR三个基因缺陷型；具有Iac启动子 控制的谷氨酸棒状杆菌IysC基因；trc启动子控制的ppc基因，其中，
[0011] 所述编码基因 ectA的核苷酸序列为序列表400〈1>所示序列；
[0012] 所述编码基因 ectB的核苷酸序列为序列表400〈2>所示序列；
[0013] 所述编码基因 ectC的核苷酸序列为序列表400〈3>所示序列；
[0014] 所述编码基因 thrA的核苷酸序列为序列表400〈4>所示序列；
[0015] 所述编码基因 IysA的核苷酸序列为序列表400〈5>所示序列；
[0016] 所述编码基因 IysC的核苷酸序列为序列表400〈6>所示序列；
[0017] 所述编码基因 ppc的核苷酸序列为序列表400〈7>所示序列；
[0018] 所述编码基因 iclR的核苷酸序列为序列表400〈8>所示序列。
[0019] 优选的，上述产生四氢嘧啶的基因工程菌，是由下述方法构建得到的：
[0020] (1)以pTrc99a质粒为载体克隆伸长盐单胞菌（CGMCC 1.6329)中的三个基因 ectABC到大肠杆菌E. coliW3110中，所述大肠杆菌保藏号ATCC 27325,构建出L-天冬氨 酸-β -半醛到四氢嘧啶的代谢途径，所述三个基因 ectABC分别表达氨基丁酸乙酰基转移 酶、二氨基丁酸氨基转移酶和四氢嘧啶合成酶；
[0021] (2)敲除编码高丝氨酸脱氢酶I和二氨基更二酸脱羧酶的基因 thrA和IysA ;在基 因组arsB位置整合由Iac启动子控制的谷氨酸棒状杆菌的天冬氨酸激酶基因 lysC，所述谷 氨酸棒状杆菌保藏号ATCC 13032;
[0022] (3)将磷酸烯醇式丙酮酸激酶编码基因 ppc的启动子替换为trc启动子，并敲除乙 醛酸循环控制基因 iclR以打开乙醛酸循环，最终获得产生四氢嘧啶的基因工程菌，其中，
[0023] 所述编码基因 arsB的核苷酸序列为序列表400〈9>所示序列。
[0024] -种产生四氢嘧啶的基因工程菌的构建方法（E. coli ECT06)，具体方法为：
[0025] (1)以 pTrc99a 质粒为载体克隆伸长盐单胞菌 Halomonas elongateCGMCCL 6329 中的三个基因 ectABC到大肠杆菌E. coli W3110 (ATCC27325)中，构建出L-天冬氨 酸-β -半醛到四氢嘧啶的代谢途径，所述三个基因 ectABC分别表达氨基丁酸乙酰基转移 酶、二氨基丁酸氨基转移酶和四氢嘧啶合成酶；
[0026] (2)敲除编码高丝氨酸脱氢酶I和二氨基更二酸脱羧酶的基因 thrA和lysA，削 弱了 L-天冬氨酸-β-半醛到赖氨酸和苏氨酸的代谢，但由于E.coli W3110中thrA基 因同时编码天冬氨酸激酶，thrA的敲除会导致天冬氨酸到L-天冬氨酸-β -半醛的合成 受阻；在基因组arsB位置整合由Iac启动子控制的谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicumATCC 13032的天冬氨酸激酶基因 lysC，保证了前体物L-天冬氨酸-β -半醛的 供应；
[0027] (3)将磷酸烯醇式丙酮酸激酶编码基因 ppc的启动子替换为trc启动子，并敲除乙 醛酸循环控制基因 iclR以打开乙醛酸循环，增强了葡萄糖到L-天冬氨酸的代谢通量，最终 获得产生四氢嘧啶的基因工程菌；其中，
[0028] 所述编码基因 ectA的核苷酸序列为序列表400〈1>所示序列；
[0029] 所述编码基因 ectB的核苷酸序列为序列表400〈2>所示序列；
[0030] 所述编码基因 ectC的核苷酸序列为序列表400〈3>所示序列；
[0031] 所述编码基因 thrA的核苷酸序列为序列表400〈4>所示序列；
[0032] 所述编码基因 IysA的核苷酸序列为序列表400〈5>所示序列；
[0033] 所述编码基因 IysC的核苷酸序列为序列表400〈6>所示序列；
[0034] 所述编码基因 ppc的核苷酸序列为序列表400〈7>所示序列；
[0035] 所述编码基因 iclR的核苷酸序列为序列表400〈8>所示序列；
[0036] 所述编码基因 arsB的核苷酸序列为序列表400〈9>所示序列。
[0037] -种四氢嘧啶的制备方法，应用上述产生四氢嘧啶的基因工程菌（E.coli ECT06)，具体步骤如下：
[0038] (1)种子培养，将所述产生四氢嘧啶的基因工程菌经斜面活化后接种至装有种子 培养基的500mL圆底三角瓶中，其中接种环每刮取一环使用种子培养基30mL，于35-39°C， 100-200rpm 摇床培养 6-8h ;
[0039] (2)发酵培养，以5-10%的接种量将步骤（1)的种子培养物接种至装有30mL发 酵培养基的500mL挡板三角瓶中，35-39°C，150-250rpm进行发酵培养，通过微量进样器补 加氨水维持pH在6. 8-7. 2,补加 l-5mL，60 % (m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行，发酵周期 20-28h，即得。
[0040] 上述步骤⑵所得四氢嘧啶的产量可达到12-18g/L。
[0041] 上述四氢嘧啶的制备方法，所得发酵液中四氢嘧啶的检测方法为：发酵液经 13000rpm高速离心2min后取上清，并用去离子水稀释到一定浓度后使用高效液相色谱法 测定四氢嘧啶含量；检测条件为：TSK-GEL C18色谱柱，流动相为2%乙腈溶液，柱温30°C， 流速lmL/min，进样量20 μ 1，紫外检测波长210nm，保留时间5min。
[0042] 优选的，上述四氢嘧啶的制备方法，所述种子培养基成分为：蔗糖20_40g， (NH 4)2SO4 l-5g，KH2PO4 l-5g，MgSO4 · 7H20 0· 2-2g，酵母粉 5-20g，玉米浆 0· 2-2mL， FeSO4 · 7H20 l-5mg，MnSO4 · H2O l-5mg，用去离子水定容到1L。上述培养基均可采用标准方 法制备获得。
[0043] 优选的，上述四氢嘧啶的制备方法，所述种子