一株组成型表达基因工程菌及其生产l-丙氨酸的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株基因工程菌及其应用，尤其涉及一株生产L-丙氨酸的基因工程菌及其应用，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002]L-丙氨酸，又名L-α -氨基丙酸(L-Alanine，L_Ala)，是生物体内与糖代谢密切相关、需求量较多的氨基酸之一。随着研究和开发的深入，L-丙氨酸在食品和医药行业得到广泛应用。
[0003]食品行业:L_丙氨酸作为添加剂，可明显提高饮料中蛋白质的利用率，同时由于可被细胞直接吸收，饮用后能迅速消除疲劳、振奋精神。L-丙氨酸甜味柔和，甜度为蔗糖的70%，能够提高甜度，可用于改善人工甜味剂味感和有机酸的酸味，使其味道更加自然。L-丙氨酸与谷氨酸钠的复合调味品，可明显改善食品风味。L-丙氨酸是合成甜味剂阿力甜的主要原料，其甜度是蔗糖的2000倍左右，目前已在多个国家和地区获准使用。
[0004]医药行业:L_丙氨酸是合成维生素B6和氨基丙醇(盐酸左氧氟沙星合成前提)的重要中间体，也是营养剂补糖氨基酸营养输液的组分之一。L-丙氨酸也是血液保存剂的主要成分，可提高血液保存期。
[0005]目前，广泛使用的L-丙氨酸生产方法为微生物转化法，通过L-天冬氨酸-β-脱羧酶催化L-天冬氨酸脱羧基反应，生产L-丙氨酸，具有反应条件温和、生产效率高、副产物少等特点，同时对设备的要求低、投资小、生产过程简单、易于操作控制，但是该转化过程生产成本相对较高。
[0006]L-天冬氨酸微生物转化生产是利用微生物产生的L-天冬氨酸酶，转化底物富马酸和氨水获得的(附图1)。富马酸来源广泛，价格低廉。
[0007]本发明在一个工程菌株中实现L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-脱羧酶的共表达，以富马酸和氨水为底物生产L-丙氨酸，可以有效降低原料成本，同时在富马酸转化时反应体系中富余的NH3可以与L-天冬氨酸脱羧产生的CO2发生中和反应，产生副产品碳酸钱，进而进一步降低成本。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种新的菌株品种，可以同时产生L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β -脱羧酶，转化富马酸生产L-丙氨酸，以替代现有L-丙氨酸生产工艺的原料L-天冬氨酸，降低生产成本。
[0009]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
[0010]一、本发明的基因工程菌株，是以可以产生L-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌1.Escherichia coliXlCC 11022S(等同于 CGMCC N0.5450)作为出发菌株，通过将 L-天冬氨酸-β -脱羧酶基因(如MoS因)导入该菌株并表达，构建而成的重组菌株CICC 11032S。
[0011]进一步的，该基因工程菌株构建步骤如下: (I)人工合成tac启动子，其序列如SEQ ID N0.2所示。
[0012](2)以上述合成的tac启动子为模板，设计引物如下:
tac.f: 5’-TTAACGCGTATCACTGCATAATTCGTG-3’ (划线部分是 #_/?/Ι 核酸内切酶酶切位点)；
tac.r: 5’-TTATCTAGATCCACACATTATACGAGC-3’ (划线部分是 ZAaI 核酸内切酶酶切位点)。
[0013](3)以上述引物进行tac启动子的扩增，并用相应的核酸内切酶酶切处理扩增的DNA片段和载体pET28a (购自Novagen公司，其核酸序列如SEQ ID N0.3所示)，DNA连接酶连接，获得重组质粒，命名为pETPtac。
[0014](4)提取睾丸酮丛毛单胞菌(testosteroni) CICC 11023s (等同于CGMCC N0.6083)基因组，以基因组为模板，扩增L-天冬氨酸-β -脱羧酶基因，设计引物如下:
asd.f: 5’ - GGCATATGATGAGCAAGGATTATCAG -3’ (划线部分是 UeI 核酸内切酶酶切位点)；
asd.r: 5’-ATTCTCGAGTCAGCGCTTGTTCCCTTG-3’ (划线部分是 ZAoI 核酸内切酶酶切位点)。
[0015](5)以上述引物进行L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因的扩增(其核酸序列如SEQ IDN0.1所示)，并用相应的核酸内切酶酶切处理扩增的DNA片段、载体PETPta。和pETDuet_l(购自Novagen公司，其核酸序列如SEQ ID N0.4所示)，DNA连接酶连接，获得重组载体，分别命名为 PETPtac-SSO和 pETDuet- ascL 然后设计引物 asd.r (EcoRI) 5’ -GTTGAATTCTCAGCGCTTGTTCCCTTG-3’(划线部分是AcoRI核酸内切酶酶切位点)，与tac.f引物共同使用，以PETPta。-aso为模板，扩增DNA片段P ta~asd,插入载体pETDuet-aso的Mlul和AcoRI酶切位点，替换pETDuet-as难]表达调控基因Iacl和启动子T7，构建获得载体PETPp-Mi/,故pETPp-aso可以不需诱导，组成型表达aso基因。将载体ρΕΤΡ 转化到可以表达L-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌S coli CICC 11022S中，获得工程菌株，命名为S coli/pETPp-a5i/o
[0016]二、利用本发明的大肠埃希氏菌工程菌生产L-丙氨酸的方法，其特征包括发酵培养基培养工程菌，然后利用发酵液转化富马酸生产L-丙氨酸。
[0017]进一步，具体步骤如下:
(I)菌种活化
将基因工程菌株划线到含有100 mg/L氨苄青霉素和1.5 - 2.0%琼脂的LB培养基平板上，30±1°C培养12±2小时。
[0018](2)种子培养
无菌条件下，用灭菌后的牙签挑取步骤(I)平板上的单菌落，接种发酵培养基，30土1°C摇床培养12 ± 2小时，获得种子液。
[0019]其中，上述步骤(I)中所述LB培养基配方为:1 L水中加入酵母粉5 g，蛋白胨10g，氯化钠10 g，115°C灭菌30分钟。
[0020]上述步骤(2)中所述发酵培养基配方为:1 L水中加入富马酸10 g，玉米浆干粉10g，硫酸镁0.2 g，磷酸二氢钾1.0 g，氯化钠1.5 g，氨水调节pH 6.5 - 7.5。
[0021](3)发酵培养
将种子液以0.1 - 5.0%接种量接种到发酵培养基中，30± 1°C摇床培养12±2小时，获得发酵液。
[0022](4)底物转化
将富马酸加入转化罐中，以氨水调节PH为7.0 - 8.5ο然后将发酵液12000 rpm离心
5min，无菌生理盐水悬浮菌泥，加入转化罐中，调节反应体系细胞密度(0D_) 10 - 20，调节温度40 - 50°C，搅拌转速50 - 200 rpm，转化8 - 12小时。
[0023](5)检测方法
L-天冬氨酸和L-丙氨酸定量测定方法采用高效液相色谱(High performanceliquid chromatography, HPLC)柱前衍生方法(Hender Jff, et al., Rapid, accurate,sensitive and reproducible HPLC analysis of amino acids.Agilent Technologies.USA.2000) o
[0024]本发明成功实现了将L-天冬氨酸-脱羧酶基因在携带L-天冬氨酸酶基因的Ε.coli CICC 11022S中的表达，并以此基因工程菌株S cWi/pETPp-aso转化富马酸生产L-丙氨酸，具