产能检测磺胺药物的蛋白质的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

文档序号:9300458阅读:598来源:国知局
产能检测磺胺药物的蛋白质的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域中产能检测磺胺药物的蛋白质的重组大肠杆菌及其构 建方法与应用。
【背景技术】
[0002] 食品中残留的兽药会破坏胃肠道菌群平衡,并可导致长期的腹泻、维生素缺乏及 影响其它药物的疗效,从而影响人体健康。磺胺药物是一类具有对氨基苯磺酰胺结构的化 学药物,磺胺药物价格便宜、使用方便,广泛应用于动物疾病防治和促生长,其在动物源食 品中的残留问题已经引起人们的广泛关注。如何确保动物源食品质量安全,除了严格控制 产业链中磺胺药物的使用外,建立动物源食品中磺胺药物的快速检测方法则显得尤为重 要。
[0003] 目前磺胺药物的检测方法主要有仪器法(包括高效气相色谱、高效液相色谱以及 色质联用技术等)、微生物法、免疫分析方法以及受体分析方法等。这些方法各有特点:仪 器法准确、可靠、灵敏度高,是一种确证方法,但是不适合现场快速检测;微生物法可同时检 测多种抗生素,但灵敏度不高、检测时间长,且无法定量;免疫分析方法基于抗原抗体的特 异结合,具有灵敏度高、特异性强、可定量检测等优势,但由于灵敏度高且可识别同一类药 物的抗体难以获得,制约了其在兽药残留检测领域的应用。欧盟制定了磺胺药物总量在动 物源食品中的最高残留限量为100ng/mL。如能获得可同时检测多种磺胺药物的物质将有助 于磺胺药物的检测。

【发明内容】

[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何检测多种磺胺药物。
[0005] 为解决上述技术问题,本发明首先提供了一株能高效产生可用于检测多种磺胺药 物的蛋白质flop的重组大肠杆菌。
[0006] 本发明所提供的一株能高效产生可用于检测多种磺胺药物的蛋白质flop的重组 大肠杆菌是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21 (DE3) -pET28b_f Iop,其在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 10068。该菌种已于2014 年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。
[0007] 为解决上述技术问题,本发明还提供了构建重组大肠杆菌的方法。
[0008] 本发明所提供的构建重组大肠杆菌的方法,包括将用于检测多种磺胺药物的蛋白 质flop的编码基因导入受体大肠杆菌中得到产所述用于检测多种磺胺药物的蛋白质flop 的重组大肠杆菌;
[0009] 所述用于检测多种磺胺药物的蛋白质flop为如下a)或b)的蛋白质:
[0010] a)由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
[0011] b)将SEQ ID No. 1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加得到的具有用于检测多种磺胺药物的蛋白质flop活性的由a)衍生的蛋白质。
[0012] 其中,SEQ ID No. 1由314个氨基酸残基组成。
[0013] 上述构建重组大肠杆菌的方法中,所述用于检测多种磺胺药物的蛋白质flop的 编码基因为如下1)或2)或3)的核酸分子:
[0014] 1)其编码序列是SEQ ID No. 2的DNA分子或cDNA分子;
[0015] 2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述用于检测多种磺胺药物的 蛋白质flop的DNA分子或cDNA分子;
[0016] 3)与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且编码所述用于检测多 种磺胺药物的蛋白质flop的DNA分子或cDNA分子。
[0017] 其中,SEQ ID No. 2由945个核苷酸组成,其编码序列是第1-945位。
[0018] 这里使用的术语"同一性"指核酸序列间的序列相似性。"同一性"包括与本发明 的SEQ ID No. 2所示的DNA分子或cDNA分子具有75 %或更高,或85 %或更高,或90 %或更 高,或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用 计算机软件,两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(%)表示,其可以用来评价相关 序列之间的同一性。
[0019] 所述严格条件是在2XSSC,0. 1% SDS的溶液中,在68°C下杂交并洗膜2次,每次 5min,又于0. 5 X SSC,0. 1 % SDS的溶液中,在68°C下杂交并洗膜2次,每次15min。
[0020] 上述75%或75%以上同一性,可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0021] 上述构建重组大肠杆菌的方法中,所述用于检测多种磺胺药物的蛋白质flop的 编码基因通过重组表达载体导入所述受体大肠杆菌中。
[0022] 上述构建重组大肠杆菌的方法中,所述受体大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3); 所述重组表达载体是将所述用于检测多种磺胺药物的蛋白质flop的编码基因插入载体 pET_28b (+)的多克隆位点得到的重组表达载体。
[0023] 上述构建重组大肠杆菌的方法中,所述重组表达载体可含有序列SEQ ID No. 2所 示的用于编码用于检测多种磺胺药物的蛋白质flop的DNA序列;进一步的,所述重组载体 具体可 pET-28b (+) -f Iop ;所述 pET-28b (+) -f Iop 为将 pET-28b (+)载体的 NedI 和 XhoI 识 别位点(识别序列)间的DNA序列替换为SEQ ID No. 2所示的用于编码用于检测多种磺胺 药物的蛋白质flop的DNA序列,保持其它DNA序列不变,得到表达SEQ ID No. 1所示的用 于检测多种磺胺药物的蛋白质flop的重组载体。
[0024] 上述构建重组大肠杆菌的方法中,所述重组大肠杆菌可为大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)BL21 (DE3)-pET28b_flop,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 10068。
[0025] 本发明所提供的由上述任一种构建重组大肠杆菌的方法构建的重组大肠杆菌也 属于本发明保护的范围。
[0026] 为解决上述技术问题,本发明还提供了所述用于检测多种磺胺药物的蛋白质flop 的制备方法。
[0027] 本发明所提供的所述用于检测多种磺胺药物的蛋白质flop的制备方法,包括培 养所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)-pET28b_flop或由上述任一种构建重 组大肠杆菌的方法构建的重组大肠杆菌,得到所述用于检测多种磺胺药物的蛋白质flop。
[0028] 所述用于检测多种磺胺药物的蛋白质flop的制备方法具体可按照如下方法制 备,在液体培养基中培养所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)-pET28b-flop 或由上述任一种构建重组大肠杆菌的,收集所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)-pET28b-flop或由上述任一种构建重组大肠杆菌的代谢物,从所述代谢物中得 到所述用于检测多种磺胺药物的蛋白质flop。
[0029] 为解决上述技术问题,本发明还提供了下述1)-8)中的任一种应用:
[0030] 1)所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)-pET28b_fIop 在生产所述 用于检测多种磺胺药物的蛋白质flop中的应用;
[0031] 2)所述构建重组大肠杆菌的方法在生产所述用于检测多种磺胺药物的蛋白质 flop中的应用;
[0032] 3)由所述构建重组大肠杆菌的方法构建的重组大肠杆菌在生产所述用于检测多 种磺胺药物的蛋白质flop中的应用;
[0033] 4)所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)-pET28b_fIop 在检测磺胺 药物中的应用;
[0034] 5)所述用于检测多种磺胺药物的蛋白质flop在检测磺胺药物中的应用;
[0035] 6)所述构建重组大肠杆菌的方法在检测磺胺药物中的应用;
[0036] 7)由所述构建重组大肠杆菌的方法构建的重组大肠杆菌在检测磺胺药物中的应 用;
[0037] 8)所述用于检测多种磺胺药物的蛋白质flop的制备方法在检测磺胺药物中的应 用。
[0038] 上述应用中,所述磺胺药物具体可为磺胺异噁唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺 胺吡啶、磺胺甲二唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧吡嗪、磺 胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺甲噁唑、磺胺氯哒嗪、磺胺乙氧哒嗪、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、 磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺胍、磺胺间甲氧哒 嗪、磺胺硝苯、磺胺嘧啶、磺胺溴二甲嘧啶、氨苯磺胺、磺胺多辛和酞磺胺噻唑中的全部或部 分任一种。
[0039] 上述应用中,所述应用为非疾病诊断和/或非治疗的应用
[0040] 实验证明,将SEQ ID NO. 2所示的flop基因通过重组表达载体pET-28b (+) -flop 导入大肠杆菌BL21 (DE3)中,经过筛选得到大肠埃希氏菌(Escherichia coli) BL21 (DE3) -pET28b-f Iop (即为 BL21-pET28b-f lop-7 菌株),具有最高的蛋白质 f Iop 产率, 200mL含有大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)-pET28b-flop的LB液体培养基经 培养、菌体破碎、离心收集上清进行蛋白质纯化后可以收获3. 89mg的蛋白质flop,适于作 为蛋白质flop的生产菌株。以大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)-pET28b_flop 表达的蛋白质flop对于磺胺二甲基嘧啶标准品的检测限为4. 82ng/mL,可以识别包括磺胺 二甲基嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑等在内的至少 29种磺胺药物。
[0041] 保藏说明
[0042] 菌种名称:大肠埃希氏菌
[0043] 拉丁名:Escherichia coli
[0044] 菌株编号:BL21 (DE3) -pET28b_flop
[0045] 保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0046] 保藏机构简称:CGMCC
[0047] 地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0048] 保藏日期:2014年11月27日
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