甲基营养型芽孢杆菌产芽孢发酵培养基及其培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种应用响应面法和单因素实验设计对甲基营养型芽孢杆菌的芽孢 高密度发酵生产工艺优化技术，得到了适用于甲基营养型芽孢杆菌产芽孢的发酵培养基及 其培养方法。
【背景技术】
[0002] 在防治植物病原真菌病害上，化学农药做出了巨大贡献。然而，化学农药产生的环 境等问题却愈来愈严重。因此，生物防治被提上了日程，为了解决这个问题，有必要挖掘新 的微生物资源，开发新型生物农药。
[0003] 芽孢杆菌在自然界分布广泛，可产生多种抗菌活性物质。目前已广泛应用于医药、 农药、食品、饲料加工、环境污染治理等各个行业，具广阔应用前景。芽孢杆菌可以产生内生 孢子抵御不良环境，所以，芽孢与营养体相比抗逆性明显增强，作为生物制剂更加稳定，因 此目前已经形成商品化的大部分是芽孢杆菌的芽孢制剂。
[0004] 甲基营养型芽抱杆菌（Bacillus methylotrophicus)是 2010 年 Munusamy Madhaiyan等人报道的新种，在污水处理、水产养殖、生物防治、食品等方面的应用也相继有 报道。甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus9912是由中国科学院沈阳应用 生态研究所胡江春等人从辽宁渤海海泥中分离得到的优良菌株；经田间防治效果试验，对 多种真菌性病害，如黄瓜灰霉病、番茄灰霉病、葡萄灰霉病、苹果腐烂病等，有明显的防治作 用，同时也可作为PGPR促进植物生长，为新型的生物杀菌剂。目前对甲基营养型芽孢杆菌 以芽孢为最终产物的发酵工艺的研究较少，并且常规的培养条件下不易产生芽孢，影响其 成为高效、低毒、低成本、货架期长的芽孢制剂，因此迫切需要对甲基营养型芽孢杆菌9912 发酵配方进行优化，摸索出最佳的培养基配方和发酵条件，以提高发酵液中芽孢含量，降低 生产成本，为大规模工业化生产可湿性粉剂奠定基础。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种运用响应曲面优化方法，优化甲基营养芽孢 杆菌9912的产芽孢发酵培养基，提高芽孢产量，同时采用廉价的农副产品作为碳源、氮源， 降低生产成本，为大规模工业生产奠定基础。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0007] (1)从6种廉价的碳源、6种廉价的氮源中筛选出芽孢产量和转化率都很高的原 料；筛选碳源时用酵母膏作为唯一的氮源，酵母膏浓度为0.8% ;筛选氮源时用葡萄糖作 为唯一的碳源，葡萄糖的浓度为1. 1% ;其余成分是诱导芽孢形成的盐溶液，具体成分如 下：KH2PO40.00 5 %，（NH4) 2S040 . 006 %，MnSO40.00 4 %，CaCO30.00 4 %，MgSO4. 7Η200· 005 %， ρΗ6. 5 ；
[0008] (2)将步骤（1)筛选出的4种碳源、2种氮源和诱导芽孢形成的盐溶液组分，共11 个因素，根据Plackettt-Burman Design,筛选出对芽孢产量和转化率有显著影响的4个因 素：玉米面、葡萄糖、黄豆饼粉、CaCO3，培养条件和要求同步骤（I);
[0009] (3)步骤（2)筛选出的有显著影响的因素经最陡爬坡试验设计，其余因素的水平 为零点，逼近最大芽孢产量区找到响应面试验各因素水平的中心点，培养条件和要求同步 骤⑴；
[0010] (4)根据Central Composite Design,进行响应面分析确定步骤（3)中3个显著 因素的最适浓度，确定最佳发酵培养基配方，培养条件和要求同步骤（1);
[0011] (5)将以上步骤优化出的最佳发酵培养基配方，采用单因素实验设计，考查PH、接 种量、种龄、装液量对芽孢产量的影响，培养条件和要求同步骤（1);
[0012] (6)最优培养基配方和最优发酵条件的验证
[0013] 上述步骤（6)发酵罐验证的方法为：根据实验所得的最优发酵培养基和发酵条 件，500L的发酵罐装液量300L，培养条件为：罐压0. 05~0. 06Mpa，风量1:0. 4~1:0. 6vvm， 转速220~250rpm，培养温度为35~37°C，24~28h，显微镜检测芽孢转化率达到80%以 上即可终止发酵。
[0014] 上述步骤（1)中的发酵活性芽孢产量的测定方法为：将发酵液80°C下水浴保温 lOmin，杀死营养体，采用连续稀释涂布平板法计算芽孢数目。
[0015] 上述步骤（1)、（2)、（3)、（4)、（5)的具体发酵培养的方法如下：
[0016] 1)挑一环试管斜面上的菌种接种于改良淀粉平板培养基上，30°C下培养2~3天， 显微镜下检测，选择中央芽孢形成均一，两端着色清晰的大菌落作为发酵种子；
[0017] 2)挑一环步骤（1)所述的发酵种子，接种于液体种子培养基，其配方如下：葡萄糖 1%，玉米面 1. 8%，麸皮0· 35%，黄豆饼粉0· 1%，KH2PO40.00 5 ~0· 006%，（NH4)2SO40.00 6 ~ 0· 008 %，MnSO40.00 4 ~0· 005 %，CaCO30.00 4 ~0· 005 %，MgSO4. 7Η200· 005 ~0· 006 %， ΡΗ6. 5,装液量为：500ml的摇瓶装50ml种子液，培养温度36 °C，转速180rpm条件下培养 15~18h，作为发酵种子液；
[0018] 3)将步骤（2)得到的发酵种子液，按照8~10%的接种量接入发酵培养基，装液 量为：500ml的摇瓶装50ml发酵培养基，培养温度36°C，转速180rpm条件下培养至芽孢转 化率80 %以上终止发酵，计算芽孢数目。
[0019] 本发明的有益效果：
[0020] (1)它既能满足摇瓶实验的需要，又能成功的将摇瓶发酵结果放大到发酵罐；
[0021] (2)利用本发明的培养基进行培养后，在常规液体培养基上不易产芽孢的甲基营 养芽孢杆菌的转化率由1~20%提高至90%以上，芽孢产量达到10X 10scfu/ml及以上， 总的活性芽孢数比其他培养基发酵提高数十倍，同时采用廉价的农副产品，也降低了生产 成本，具有工业化生产的实际意义；
[0022] (3)响应面分析法（RSM)是根据几个变量和一个或多个因变量之间的回归关系， 通过回归分析得到提取条件和提取结果之间的回归关系，从而求得最佳提取工艺的一种数 学统计方法。目前利用该方法优化甲基营养型芽孢杆菌的发酵条件，从而提高芽孢产量的 文献还未见报道。
【附图说明】
[0023] 图1为玉米淀粉与葡萄糖对芽孢产量的响应面三维图；
[0024] 图2为玉米淀粉与黄豆饼粉对芽孢产量的响应面三维图；
[0025] 图3为葡萄糖与黄豆饼粉对芽孢产量的响应面三维图；
[0026] 图4为葡萄糖与碳酸钙对芽孢产量的响应面三维图；
[0027] 图5为黄豆饼粉与碳酸钙对芽孢产量的响应面三维图。
【具体实施方式】
[0028] 实施例1
[0029] 菌种的活化
[0030] 将甲基营养型芽孢杆菌9912-D划线接种于改良淀粉琼脂培养基，30°C培养48h， 挑取经显微镜观察后，将典型单菌落再次划线纯化后接种于改良淀粉试管斜面，30°C培 养48h备用。其在改良淀粉琼脂培养基上的典型菌落形态为边缘不规整，表面干燥稍有 皱起，菌落较厚，乳脂色；显微镜下的细菌形态：细胞杆状或柱状，大小〇. 6~0. 8X 1. 5~ 3. 0 μ m，芽孢中生柱状或椭圆，不膨大，一条鞭毛，端生或侧端生。
[0031] 改良淀粉培养基组成为：可溶性淀粉2%，牛肉膏0.5%，酵母膏0.5%， NaClO. 5%，琼脂L 8%。pH自然，115°C高压蒸汽灭菌30min(或121°C灭菌20min)。
[0032] 实施例2
[0033] 实验设计与统计分析
[0034] 2. 1单因素试验设计筛选合适的碳源和氮源
[0035] 碳源既能为微生物生长繁殖提供能源，又是合成菌体必须的成分，微生物自身存 在的酶系有差别，利用不同碳源代谢对发酵产物品质的影响也是不同。氮源是构成细胞蛋 白和核酸物质的来源，与菌体正常代谢有重要关系。有研究报道，一些农副产品，如玉米浆、 玉米面、黄豆饼粉等能在发酵后期提供芽孢形成必须的辅酶、氨基酸等。在发酵培养基中选 择6种不同的碳源，即玉米面、麸皮、葡萄糖、玉米淀粉、蔗糖、糊精，和6种不同的氮源，即玉 米浆、黄豆饼粉、大豆蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨、磷酸二氢铵，研究它们对芽孢产量的影响。
[0036] 筛选碳源时用酵母膏作为唯一的氮源，酵母膏浓度为0.8% ;筛选氮源时用葡萄 糖作为唯一的碳源，葡萄糖的浓度为1. 1% ;其余成分是诱导芽孢形成的盐溶液，具体成分 如下：KH2PO40.00 5%，（NH4)2SO40.00 6%，MnSO40.00 4%，CaCO30.00 4%，MgSO4. 7Η200· 005%， ρΗ6· 5〇
[0037] 玉米面、麸皮、葡萄糖、玉米淀粉分别作为碳源，黄豆饼粉、大豆蛋白胨分别作为氮 源时，芽孢产量都很高，芽孢转化率85~99%以上，芽孢产量在2 X IO8~5. 5 X 10scfu/ml， 因此，选择这5种碳、氮源作为培养基成分进行接下来的试验设计。
[0038] 2. 2Plackett-Burman Design
[0039] 上述1中筛选出的4种碳源、2种氮源和诱导