一种水牛卵母细胞去核的方法
【专利说明】
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，特别涉及一种水牛卵母细胞去核的方法。
【【背景技术】】
[0002]在水牛的体细胞核移植操作过程中，卵母细胞去核是至关重要的一步，去核采用的主要方法为盲吸法和荧光染色法。盲吸就是吸除极体及其周围的少量卵母细胞质，其最大的缺点就是去核效率低且吸取的胞质多，影响了之后重组胚的发育。而荧光染色法就是先将卵母细胞用5 μ g/mL的Hoechest 33342染色15min，焚光显微镜下指定去核，其去核效率高，但由于紫外光照射会对卵母细胞造成损伤，目前本方法也主要用于去核效率的检测。近年来，发展了纺锤体成像系统，其利用纺锤体的偏光原理，通过其指导去核时可见纺锤体区域较其它部位明亮，且不断闪烁。吸取纺锤体、极体和周围少量胞质，在去核管中，清晰可见闪亮的纺锤体，确定去核。其去核无损伤且去除胞质少，然而对于新手而言，要看到闪烁的纺锤体需要相当长时间练习，而且由于亮光闪烁微弱，水牛卵母细胞质内脂滴多、透光性差，很多卵母细胞都看不到闪烁的纺锤体，也无法精准去核。
【
【发明内容】
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[0003]本发明提供了一种水牛卵母细胞去核的方法，本发明采用稍高浓度的细胞松弛素B(Cytochalasin B, CB)培养水牛卵母细胞一段时间，随后大部分卵母细胞内的纺锤体会从细胞中分离出来，从而在卵母细胞膜表面形成一个小突起，然后吸除极体和小突起。本发明在去核过程中只损耗极少量的卵母细胞质，而对于少量未形成突起的卵母细胞，可采用纺锤体成像系统观测辅助去核，从而提尚去核效率。
[0004]本发明所采取的技术方案是:一种用于水牛卵母细胞去核的方法，所述方法包括以下步骤:1)从屠宰场卵巢获取卵丘卵母细胞复合体(COCs)，进行成熟培养；2)用10yL枪头轻缓吹打成熟培养后的COCs，去除卵丘细胞，剩下卵母细胞；3)挑选含第一极体的M II期卵母细胞，用于去核；4)将水牛卵母细胞转入含有7.5 μ g/mL细胞松弛素B (CB)的培养液中，38.5°C,5% CO2、饱和湿度的条件下培养30min ;5)将处理后的水牛卵母细胞转入覆盖石蜡油的30-40 μ L去核操作液内；及6)在配有纺锤体成像系统的倒置显微镜下，用固定管固定水牛卵母细胞，注射针翻转卵母细胞，找到卵母细胞膜边缘的小突起，并在纺锤体成像系统，确定可见小突起区域较其它部位明亮，且不断闪烁，即表明其为纺锤体；吸取纺锤体、极体和周围少量胞质，在去核管中，清晰可见闪亮的纺锤体，确定去核。
[0005]进一步地，在步骤I)中，成熟培养时间为22_24h。
[0006]进一步地，在步骤4)中，所述培养液为:TCM199+10% FBS+7.5 μ g/mL CB。
[0007]进一步地，在步骤5)中，去核液为 TCM199+10% FBS+5 μ g/mL CB。
[0008]进一步地，所述固定管的外径为120 μπι。
[0009]进一步地，所述注射针的内径为20 μ m。
[0010]本发明的有益效果是:
[0011]本发明通过细胞松弛素B(Cytochalasin B, CB)培养水牛卵母细胞，结合纺锤体成像系统观测去核，在不影响卵母细胞质支持重组胚发育能力的前提下，能够有效的提高去核效率，减少去核时间，并且在一定程度上简化去核步骤。
【【具体实施方式】】
[0012]下面结合具体的实施例来进一步说明本发明，但并不以此来限制本发明的范围。
[0013]实施例1采用本发明所述方法对水牛卵母细胞进行对比去核实验
[0014]1.试验过程
[0015]1.1试验材料
[0016]自屠宰场卵巢获取的卵丘卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte-complexes, COCs)、培养液(TCM199，7.5 μ g/ml CB, 10% FBS)、去核操作液(TCM199，5 μ g/ml CB, 10% FBS)。
[0017]1.2试验设计
[0018]本试验采用本发明所述方法、盲吸法以及单采用纺锤体成像系统对水牛卵母细胞进行去核，分别统计分析不同方法的去核效率和去核时间，并且观察使用不同方法去核后的重组胚的融合率、分裂率和囊胚率。
[0019]1.3试验方法
[0020]I)从屠宰场卵巢获取卵丘卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte-complexes, COCs)，38.5°C、5% CO2、饱和湿度的条件下体外成熟培养22-24h ；
[0021]2)用100 μ L枪头轻缓吹打成熟培养后的COCs，去除卵丘细胞，剩下卵母细胞；
[0022]3)挑取含第一极体的M II期水牛卵母细胞用于去核操作；
[0023]4)将水牛卵母细胞转入含有7.5 μ g/mL细胞松弛素B(CB)的培养液(TCM199+10% FBS+7.5 μ g/mL CB)中，38.5°C、5% CO2、饱和湿度的条件下培养 30min ；
[0024]5)将处理后的水牛卵母细胞转入覆盖石蜡油的30-40 μ L去核操作液(TCM199+5 μ g/mLCB+10% FBS)内；
[0025]6)在配备纺锤体成像系统的倒置显微镜下，用外径为120μπι的固定管固定水牛卵母细胞，内径为20 μm的注射针翻转卵母细胞，找到卵母细胞膜边缘的小突起；同时利用纺锤体成像系统，确定可见小突起区域较其它部位明亮，且不断闪烁，即表明其为纺锤体；吸取纺锤体、极体和周围少量胞质，在去核管中，清晰可见闪亮的纺锤体，确定去核。
[0026]2.结果分析
[0027]2.1CB培养结合纺锤体成像系统观测法的去核效率
[0028]通过CB培养结合纺锤体成像系统观测去核，以60个卵母细胞计，88.3%的卵母细胞膜边缘可见小突起，其去核时间约为15min，去核效率为98.3%。盲吸法的去核时间为12min，但由于水牛卵母细胞内脂滴多，去核效率仅为70%。单采用纺锤体成像系统去核时间为30min，去核效率为81.6%。综合可见，CB培养结合纺锤体成像系统观测去核不仅去核率高而且耗时短，且一定程度上简化了去核步骤。
[0029]2.2CB培养结合纺锤体成像系统法对体细胞核移植重组胚发育能力的影响
[0030]对三种方法去核后的重组胚的融合率、分裂率和囊胚率进行统计分析，结果显示CB培养结合纺锤体成像系统观测去核后的重组胚的融合率、分裂率和囊胚率分别为 76.7 % ±5.2 %、50.5±8.6 %Λ6.2±6.9 % ;盲吸法为 73.2±6.8、42.3±7.9 %,10.8±3.6% ;纺锤体成像系统去核法为78.4±6.3%,49.8±7.3%、15.6±4.8%0由此可见，本方法并不影响体水牛细胞核移植重组胚的发育能力。
[0031] 综上所述，本发明CB培养结合纺锤体成像系统观测去核不仅去核率高而且耗时短，且一定程度上简化了去核步骤，同时不影响重组胚的发育能力。
【主权项】
1.一种用于水牛卵母细胞去核的方法，其特征在于:所述方法包括以下步骤: 1)从屠宰场卵巢获取卵丘卵母细胞复合体(COCs)，38.5°C、5% CO2、饱和湿度的条件下体外成熟培养22-24h ; 2)用100μ L枪头轻缓吹打成熟培养后的COCs，去除卵丘细胞，剩下卵母细胞； 3)挑选含第一极体的MII期卵母细胞，用于去核； 4)将水牛卵母细胞转入含有7.5 μ g/mL细胞松弛素B(CB)的培养液中，38.5°C、5%CO2、饱和湿度的条件下培养30min ； 5)将处理后的水牛卵母细胞转入覆盖石蜡油的30-40μ L去核操作液内； 6)在配有纺锤体成像系统的倒置显微镜下，用固定管固定水牛卵母细胞，注射针翻转卵母细胞，找到卵母细胞膜边缘的小突起，并在纺锤体成像系统，确定可见小突起区域较其它部位明亮，且不断闪烁，即表明其为纺锤体；吸取纺锤体、极体和周围少量胞质，在去核管中，清晰可见闪亮的纺锤体，确定去核。2.如权利要求1所述的用于水牛卵母细胞去核的方法，其特征在于:在步骤I)中，成熟培养时间为22-24h。3.如权利要求1所述的用于水牛卵母细胞去核的方法，其特征在于:在步骤4)中，所述培养液为:TCM199+10%胎牛血清(FBS)+7.5 μ g/mL CB。4.如权利要求1所述的用于水牛卵母细胞去核的方法，其特征在于:在步骤5)中，所述去核液为:TCM199+10% FBS+5 μ g/mL CB。5.如权利要求1所述的用于水牛卵母细胞去核的方法，其特征在于:所述固定管的外径为 120 μπ?ο6.如权利要求1所述的用于水牛卵母细胞去核的方法，其特征在于:所述注射针的内径为20 μπ?ο
【专利摘要】本发明提供了一种水牛卵母细胞去核方法，包括以下步骤：1)从屠宰场卵巢获取卵丘卵母细胞复合体，38.5℃、5％CO2、饱和湿度的条件下体外成熟培养22-24h；2)用100μL枪头轻缓吹打成熟培养后的COCs，去除卵丘细胞，剩下卵母细胞；3)挑选含第一极体的MⅡ期卵母细胞，用于去核；4)将水牛卵母细胞转入含有7.5μg/mL细胞松弛素B(CB)的培养液中,38.5℃、5％CO2、饱和湿度的条件下培养30min；5)将处理后的水牛卵母细胞转入覆盖石蜡油的30-40μL去核操作液内；6)在配有纺锤体成像系统的倒置显微镜下去核。采用细胞松弛素B培养卵母细胞，使用纺锤体成像系统观测辅助去核，能够有效提高去核效率。
【IPC分类】C12N5/075
【公开号】CN105018419
【申请号】CN201510445933
【发明人】杨春艳, 尚江华, 郑海英, 谷毅鹏, 黄芬香, 李婥, 梁贤威, 黄锋
【申请人】广西壮族自治区水牛研究所
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月27日