使用实时荧光定量pcr方法指示龙须菜琼胶含量的引物及指示龙须菜琼胶含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种使用实时荧光定量PCR方法指示龙 须菜琼胶含量的引物及指示龙须菜琼胶含量的方法。
【背景技术】
[0002] 琼胶不能人工合成，只能从产琼胶红藻中提取。石花菜属海藻的琼胶质量最高，但 藻体生长缓慢，形不成栽培产业。I960年，广东和海南开展了江蓠属细基江蓠繁枝变种栽 培，但其琼胶含量较低，而且琼胶质量达不到标准，我国产琼胶海藻栽培基本是空白，迫切 需要选择适当的产琼胶海藻物种并开展大规模栽培。近年来，因为龙须菜具有生长快速、便 于人工栽培和采收，且琼胶质量是江蓠属中最好等特点，被广泛栽培、应用于琼胶产业。龙 须菜藻体含胶量可以达到20 % -30 %，是产琼胶海藻中的优良品种。
[0003] 目前，我国龙须菜的栽培品系较少，并且在长期栽培过程中龙须菜出现了种质退 化现象，迫切需要筛选更多的优良品系。筛选龙须菜良种的标准主要是生长率和耐受高温 等。而作为生产上最需要的琼胶含量评估，因检测方法复杂、需要大量的藻体而一直被人们 所忽视，造成筛选出的良种虽然具有高的生长率，但琼胶含量却不高。因此，急需一种需要 藻体材料少，但能快速，准确的检测琼胶含量的技术。
[0004] 传统检测琼胶含量的技术：（摘自薛志欣2006龙须菜琼胶的提取方法研究）
[0005] 高压锅提取法：碱处理后，使用高压锅高温高压提取。
[0006] 沸水冷凝回流提取法：碱处理后，蒸馏水于盛有龙须菜的圆底烧瓶中，冷凝回流， 100 °C沸水提取。
[0007] 微波辅助高压锅提取法和超声辅助高压锅提取法：用高压锅提取前，先用微波炉 或超声波清洗器进行微波或超声波处理一定时间，其余步骤同高压锅法。
[0008] 微波提取法：碱处理和提取后的处理和高压锅提取法一样，提取时采用微波炉代 替高压锅加热。
[0009] 恒温水浴提取法：碱处理后，用90°C恒温水浴提取琼胶。提取时间和加水量同高 压锅提取法。
[0010] 上述琼胶提取方法存在一些问题：1、需要大约30g鲜重的龙须菜藻体材料才能完 成琼胶的检测，通过传统的选择育种需要很长的时间才能得到足够多的材料，费时费力。2、 提取过程涉及碱处理工序，具有一定的危险性。3、提取过程操作复杂，误差较大。
[0011] 实时荧光定量PCR(qPCR)技术是一种对待测样品中特定的序列片段进行定量分 析的方法。自1996年，关于qPCR的第一篇研究被报道后，涉及qPCR的论文数量每年呈指 数增长。目前，qPCR是一种普遍的分析特定性状表达与基因表达关系的技术。
【发明内容】
[0012] 针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供使用实时荧光定量PCR方法 指示龙须菜琼胶含量的引物及指示龙须菜琼胶含量的方法。
[0013] 使用实时荧光定量PCR方法指示龙须菜琼胶含量的引物，所述引物的序列为：
[0014] SEQ ID NO I:GME-Q-S :TGGGTAAGATGGTGCTCGGATTT 和
[0015] SEQ ID NO 2 ：GME-Q-A ：TCAAAAGTCCTCCTGAGCCCGT〇
[0016] -种使用实时荧光定量PCR方法指示龙须菜琼胶含量的方法，其特征在于：使用 荧光定量PCR分析龙须菜样本藻株GME基因相对表达量，以Gapdh和18S rRNA为内参基因， 以双内参基因的Ct值来校准藻株基因 GME相对表达量，采用2 AACT法进行数据的分析，样 本Δ ACT = (CTgme-CT 样本-1. 19,当样本藻株GME基因的2 ΛΛετ>5时，该样本藻株 即为高琼胶含量的藻株。
[0017] 所述内参基因为：Gapdh和18S rRNA。
[0018] 所述内参基因的引物为：
[0019] SEQ ID NO 3 ：Gapdh-S ：GACCGTGCGTGGAGTCATAC ；
[0020] SEQ ID NO 4 ：Gapdh-A:ATGGCTATCCCGAAAGTTGG ；
[0021] SEQ ID NO 5 ：18S rRNA-S ：GTTGGGGGCATTCGTAT ；
[0022] SEQ ID NO 6 :18S rRNA-A:ATCTCCAGTCCTCATCGTT。
[0023] 使用实时荧光定量PCR方法指示龙须菜琼胶含量的方法，具体步骤如下：
[0024] (1)实验材料的培养与收集：
[0025] 栽培海区选取一株约Ig鲜重龙须菜样本；
[0026] (2) RNA 提取；
[0027] (3)反转录合成的cDNA :
[0028] (4) qPCR ：
[0029] 利用反转录cDNA，进行qPCR反应；
[0030] qPCR反应体系如下：
[0031]
[0032] 荧光实时定量PCR的反应条件如下：
[0033] 第一步，50 °C，2min ;
[0034] 第二步，95 °C，5min ;
[0035] 第三步，95°C，15sec ;60°C，Imin ;40 个循环；
[0036] 第四步，做恪解曲线：95°C，15sec ;60°C，Imin ;95°C，15sec ;60°C，15sec ;
[0037] 荧光信号的采集设置在第三步；收集每个实验重复的目的基因 Ct值和两个
[0038] 内参基因的Ct值，两个内参基因 Ct值计算时取几何平均值。
[0039] (5)基因相对表达量分析
[0040] 采用2 Λ ACT的相对定量方法对样本龙须菜目的基因 GME的相对表达量进行分析； 样本Δ Δ CT = (CTgme-CT内参翻）样本组-L 19 ;
[0041] 当样本组2 ΛΛετ>5,该样本藻株为高琼胶含量的藻株。
[0042] 该技术具有以下优点：1、节约材料，只需要Ig鲜重龙须菜的材料就可以完成检 测。2、无需碱处理工序，减少实验的危害性。3、特异性强，灵敏度高。4、操作简单，具有很 强的推广性。5、双内参基因同时使用，误差小。6、加速良种筛选进程。
【具体实施方式】
[0043] 本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁 克（Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件来进行操作。
[0044] GME是红藻琼胶合成途径中末端的关键酶，它能够催化D型甘露糖转化为L型半乳 糖，之后L型半乳糖和D型半乳糖聚合为琼胶。Gapdh，18S rRNA是广泛用于荧光定量PCR 的内参基因，同时使用两个内参基因在一定程度上消除了由于内参基因不稳定所造成的误 差。
[0045] 使用Primer 5.0对引物进行设计，引物设计遵守以下原则：产物长度 75bp-200bp，避免二级结构，GC含量45% -55%，引物长度20-25bp，Tm值在58-62° C。引 物由北京六合华大基因科技股份有限公司进行合成。
[0046] 实施例1
[0047] (1)实验材料的培养与收集：
[0048] 栽培海区选取鲜重约16g的981品系龙须菜作为样本，另选取同等鲜重采自湛山 湾的野生品系作为对照于实验室进行驯化培养，培养条件为：添加 Pro培养基的灭菌海水， 温度20°C，盐度33%。，光照20 μ mol Hi-2S-1,培养周期12h光照：12h黑暗。驯化培养时间为 三天，三天后用于琼胶和RNA提取。
[0049] ⑵琼胶的提取：
[0050] 琼胶提取按照文献（薛定欣等，2006, Marinho-Soriano et al.，1999)略加改动 进行，具体步骤如下：
[0051] 样本和对照龙须菜各约15g鲜重藻体，平均分为三份（三个重复），每份藻体清洗 烘干后，称量记录每份藻体干重。向每份样品中添加 NaOH溶液，按照每0.1 g藻体干重添加 4mL NaOH(质量体积比2. 5% )的比例添加；在85°C恒温水浴，加热碱处理2h ;用2层300 目筛絹过滤碱处理后的藻体，再用蒸馏水洗涤藻体，至约pH = 6. 5左右；将上述龙须菜置于 锥形瓶中，向每份样品中添加蒸馏水，添加比例为每0.1 g藻体干重添加6mL蒸馏水；将锥形 瓶用棉塞封口，放于高压锅中，温度保持120-125°C，煮2小时；待高压锅温度降温至80°C左 右后，立即用4层300目筛絹重叠挤压过滤，收集滤液；滤液在室温凝固后，于-20°C冷冻过 夜；取出冷冻滤液，解冻后，用蒸馏水冲洗，再于60°C烘干至恒重，所得即为粗提琼胶，称量 并记录琼胶干重。琼胶含量百分比使用琼胶干重/藻体干重来表示。对照龙须菜平均琼胶 含量18 %，样本龙须菜平均琼胶含量20. 9 %。
[0052] ⑶ RNA 提取：
[0053] 样本和对照龙须菜0. 3g鲜重藻体，平均分为三份（三个重复），每份0. lg。总RNA 按照Omega Plant RNA Kit步骤略加改动进行提取，具体步骤如下：
[0054] 取新鲜藻体尖部0.1 g液氮研磨至粉末状，加入到含有10 μ L的巯基乙醇和500 μ L 裂解液RB的离心管中，涡旋裂解1分钟；14000Xg，室温离心5min，转移上清液置gDNA Fliter Column，柱子置于2mL的收集管；HOOOXg室温离心2min，丢弃上面的柱子，向下方 收集管中加入1/2体积的无水乙醇。用枪反复吹打混匀；将混合后的液体转移至RNA Mini Column，置于新的收集管。lOOOOXg，离心lmin，弃下层收集管中废液；将柱子重新放回收 集管中，用400 μ L RWC Wash Buffer洗脱柱子，10000 X g，离心lmin。弃掉柱子里的废液； 将柱子重新放回收集管中，用500 μ L RNA Wash Buffer II洗脱两次，同样于10000 Xg室温 离心lmin。弃掉柱子里的废液；空柱离心2min后，将柱子置于I. 5mL离心管中，向吸附柱 中央加入30 μ L DEPC水，室温下放置IOmin,于10000 X g离心Imin收集洗脱的RNA溶液。
[0055] (4)反转录：
[0056] 在提取的每份RNA中取2 μ L RNA溶液，用于琼脂糖凝胶电泳检测RNA的提取质量， 观察有无降解；另各取1 μ L RNA溶液，以DEPC水做空白对照，使用NanoDrop 2000对RNA 样品浓度和质量检测。反转录反应使用Takara的RT reagent Kit with gDNA Eraser反 转录试剂盒，按照以下程序进行：
[0057] 基因组DNA的去除。
[0058]
[0059] 42°C保温2min，立即置于冰上。
[0060] 反转录反应
[0061] 配制反应液的过程在冰上进行。按以下表格体积加入各种成分。
[0062]
[0063] 反应步骤：37°C，15min ;85°C，5sec ;立即置于冰上。
[0064] 合成的cDNA置于-20 °C保存。
[0065] (5) qPCR 实验：
[0066] 样本和对照各设置三个生物学重复，每个生物学重复再设置三个技术重复，每个 重复反转录的cDNA，利用设计好的引物（如下表）进行qPCR反应。
[0067]
[0068] qPCR反应使用罗氏的FastStart Universal SYBR Green Mas