用于检测人类mthfr基因多态性的引物对、探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，具体涉及用于检测人类MTHFR基因多态性的引物对、 探针和试剂盒。
【背景技术】
[0002] MTHFR是胞内叶酸和蛋氨酸代谢的关键酶，对叶酸和蛋氨酸代谢以及DNA甲基化 和DNA合成修复有重要关系。MTHFR酶活性降低导致还原型叶酸转变为5-甲基四氢叶酸 (5-MTHF)减少，从而使5-氟-2脱氧尿嘧啶核苷酸（FdUMP)、胸甘酸合酶（TS)与还原型叶 酸组成的三元复合物减少，从而干扰DNA的合成和修复，削弱5-FU的抗瘤作用。
[0003] 叶酸代谢障碍被认为与多种出生缺陷疾病有关，亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR) 是叶酸代谢的关键酶。MTHFR存在多种基因多态性，其中c. 677位点是目前MTHFR最常见 的突变位点，等位基因型别分别是CC，CT和TT，677C>T基因突变会导致MTHFR酶活性降低。 另外，c. 1298位点有AA，AC，CC等位基因，当基因发生突变后，同样也会引起酶的活性降低。 酶活降低使得人体摄入的叶酸无法转换成有效形式，叶酸利用率因而下降，引起人体叶酸 利用障碍，增加了发生各种出生缺陷疾病的风险，因此在临床应用上，相关基因的单核苷酸 多态性检测可作为妊娠期叶酸补充量的依据。
[0004] 目前，对基因多态性的检测分析技术方法主要包括:ARMS荧光PCR法，基因测序、 限制性片段长度多态性方法（RFLP)、基因芯片等方法。这些方法都有各自的优点和缺陷，尚 有待改进和标准化。
[0005] 1、ARMS 焚光 PCR 法：扩增阻碍突变系统（Amplification refractory mutation SyStem，ARMS)利用PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理， 设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3'碱基与模板配对时才 能出现PCR扩增带，从而检测出基因突变。
[0006] 2、直接测序：Sanger测序法因为可以读到DNA每个碱基的变化，目前被认为是检 测基因突变的金标准方法。缺点是测序步骤繁琐、耗时长，对设备和操作人员的要求较高， 检测周期长，多限于在科研单位进行，大多数医院都无法独立完成检测，较难形成标准化操 作、适合临床单位应用的体外诊断产品。
[0007] 3、限制性片段长度多态性方法（RFLP):该方法成本低，对检测设备要求低，突变 基因的检出限在5~10%。但是，劳动强度稍大、需专业的技术人员、不适于高通量检测和 大规模临床应用。
[0008] 4、基因芯片法：该方法是将探针固定于支持物上，如玻片或膜，通过PCR方法扩增 出靶基因，再通过杂交手段进行芯片杂交，应用仪器进行结果判读。该方法可以进行高密度 基因检测，但成本高、操作繁琐、检测流程相对较长，在市场推广上将受到一定限制。
[0009] 目前，还有待于开发一种操作简单快捷、特异性高、具有抗污染的检测人类MTHFR 基因多态性的试剂盒。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的之一在于提供一种操作简单快捷、特异性高、具有抗污染的检测人 类MTHFR基因多态性的试剂盒，该试剂盒可用于检测MTHFR基因 c. 677位点、c. 1298位点 的基因型。
[0011] 实现上述目的技术方案如下。
[0012] -种用于检测人类MTHFR基因多态性的试剂盒，包括有：针对MTHFR-c. 677位点的 扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO: 3所示的荧光检测探针、和/或针对MTHFR-c. 1298位点 的扩增引物和碱基组成如SEQ ID N0:6所示的荧光检测探针。
[0013] 在其中一个实施例中，所述针对MTHFR-c. 677位点的扩增引物的碱基组成如SEQ ID NO: 1 和 SEQ ID NO:2 所示。
[0014] 在其中一个实施例中，所述针对MTHFR-c. 1298位点的扩增引物的碱基组成如SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO: 5 所示。
[0015] 在其中一个实施例中，所述试剂盒包括有：针对MTHFR-c. 677位点的扩增引物 SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2以及碱基组成如SEQ ID NO:3所示的荧光检测探针、和针对 MTHFR-c. 1298位点的扩增引物SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5以及碱基组成如SEQ ID N0:6 所示的荧光检测探针。
[0016] 在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括反应液，所述扩增引物在相应反应 液中的浓度分别为：c. 677上游引物的浓度为0. 1-0. 5 μ M，c. 677下游引物的浓度 为0. 05-0. 1 μ M ;c. 1298上游引物的浓度为0. 05-0. 1 μ M，c. 1298下游引物的浓度为 0. 1~0, 5 y- M0
[0017] 在其中一个实施例中，每种所述检测探针在反应液中的浓度为：0. 1-0. 5 μM。
[0018] 在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括有UNG酶。
[0019] 本发明的另一目的是提供用于检测人类MTHFR基因多态性的检测探针。
[0020] 实现上述目的的技术方案如下。
[0021] 用于检测人类MTHFR基因多态性的检测探针，包括有：针对MTHFR基因 MTHFR-c. 677位点的碱基组成如SEQ ID NO: 3所示的荧光检测探针、和/或针对MTHFR基因 MTHFR-c. 1298位点的碱基组成如SEQ ID N0:6所示的荧光检测探针。
[0022] 本发明的另一目的是提供用于检测人类MTHFR基因多态性的检测引物。
[0023] 实现上述目的的技术方案如下。
[0024] 用于检测人类MTHFR基因多态性的引物，包括有：针对MTHFR-c. 677位点的碱基组 成如SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示的引物、和/或针对MTHFR-C. 1298位点的碱基组成 如 SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:5 所示引物。
[0025] 本发明具有以下有益效果：
[0026] (1)本发明采用经过大量实验从众多的引物中，挑出了具有高特异性的引物、焚光 探针，再进一步优化检测体系，可实现高特异性地检测MTHFR基因 c. 677位点、c. 1298位点 的基因型；其次，还具有检测线性广的优点，以25 μ L检测体系可检测2ng-600ng人基因组 DNA ;而且，还具有准确性高，检测结果与金标准测序方法100%-致。
[0027] (2)闭管操作，检测速度快，检测过程只需90分钟即可完成。
[0028] (3)抗污染，试剂盒中含有UNG酶，可以消除由于PCR产物导致的污染。
【附图说明】
[0029] 图Ia为实施例2中MTHFR-c. 677野生型样本结果示意图；
[0030] 图Ib为实施例2MTHFR-C. 677突变纯合型样本结果图；
[0031] 图Ic为实施例2MTHFR-C. 677杂合型样本结果图；
[0032] 图Id为实施例2MTHFR-C. 677杂合型测序结果图；
[0033] 图Ie为实施例2MTHFR-C. 677引物为SEQ ID NO:7-8的检测结果图；
[0034] 图2a为实施例3MTHFR-C. 1298野生型样本结果图；
[0035] 图2b为实施例3MTHFR-C. 1298突变纯合型样本结果图；
[0036] 图2c为实施例3MTHFR-C. 1298杂合型样本结果图；
[0037] 图2d为实施例3MTHFR-C. 1298杂合型测序结果图；
[0038] 图2e为实施例3MTHFR-C. 1298引物为SEQ ID NO:9-10的检测结果图；
[0039] 图2f为实施例3MTHFR-C. 1298引物为SEQ ID NO: 11-12的检测结果图。
【具体实施方式】
[0040] 本发明采用的具体技术原理是在每个检测靶点的PCR体系中，加入一对非等量的 特异性引物和一条覆盖SNP位点的荧光探针。首先通过不对称PCR扩增出含检测位点的单 链寡核苷酸靶序列，其后运行熔解曲线荧光采集程序。从低温到高温的熔解过程中，荧光探 针与单链靶序列形成的杂交产物从互补配对到解链变性，期间的荧光值变化记录为熔解曲 线。将熔解曲线对温度作一阶负导数可获得杂交产物的熔解峰图，并计算出相应的熔点（Tm 值）。由于SNP位点的碱基变化不同，导致靶序列与探针的匹配程度不一，因此杂交产物的 温度稳定性及熔解行为各有差异。若单链靶序列中只有1种等位基因，并与探针完全匹配， 则只有1个熔解峰，其Tm值较高；反之，单一熔解峰的Tm值较低；若靶序列含有2种等位基 因，则会出现2个熔解峰，Tm值分别与两种纯合等位基因的熔解峰的Tm值一致。通过对熔 解峰图的分析可对检测位点基因型进行判读。
[0041] 为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的 实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0042] 除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域 的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实 施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语"和/或"包括一个或多个相关的所 列项目的任