一种新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]噬菌体T7编码其自身的RNA聚合酶，该RNA聚合酶是相对简单和高效。它可以和23个bp核苷酸启动子序列结合启动转录，这个序列在大肠杆菌基因组中不存在。转录非常的迅速有效，转录速度是大肠杆菌RNA聚合酶的五倍。
[0003]这些性质使T7RNA聚合酶和它的启动子系统被用于控制在大肠杆菌和其它生物中的外源基因的表达。为了表达重组蛋白质，PCR然后克隆是必需的。克隆需要时间，而且许多的毒性基因不能在体内被克隆，不能以尚通量的方式地完成。
[0004]本发明开发出一种方法，将T7启动子和终止子添加到目标基因片来体外表达蛋白。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是:基于上述问题，本发明提供一种新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法。
[0006]本发明解决其技术问题所采用的一个技术方案是:一种新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法，包括以下步骤:
[0007](I)第一轮PCR反应:使用基因特异性引物组，用PCR扩增每一个潜在的开放阅读框；
[0008](2)第二轮PCR反应:使用一个通用引物组扩增，第二轮PCR反应在5’端引入了噬菌体T7启动子，在3’端引入噬菌体T7终止子，步骤(I)得到的PCR产物等分试样被转移到含有T7组氨酸启动子片段和T7终止子片段中；
[0009](3)蛋白质合成:步骤(2)的PCR产物纯化后，添加体外大肠杆菌细胞提取物，并加入T7RNA聚合酶，蛋白质合成反应在30°C过夜；
[0010](4)蛋白质纯化:组氨酸标记的蛋白是用镍涂覆的磁珠进行纯化。
[0011]进一步地，步骤(I)中基因特异性引物组包括引物I和引物2，引物1:5’端序列为若干个碱基加上16?18个碱基的基因特异性序列，引物2:3’端序列为与5’端相同数量个碱基加上16?18个碱基的基因特异性序列。
[0012]进一步地，步骤(2)中启动子片段序列:5’-GAT GCC GGC CAC GAT GCG TCC GGCGTA GAG GAT CGA GAT CTC GAT CCC GCG AAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCA CAACGG TTT CCC TCT AGA MT MT TTT GTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CCA TGC ATC ATCATC ATC ATC ΑΤ-3’ 。
[0013]进一步地，步骤(2)中终止子片段序列:5' -GGC GAC CAC ACC CGT CCT GTG GATATC CGG ATA TAG TTC CTC CTT TCA GCA AAA AAC CCC TCA AGA CCC GTT TAG AGG CCC CAAGGG GTT ATG CTA GTT ATT GCT CAG CGG TGG CAG CAG CCA ACT CAG CTT CCT TTC GGG CTTTGT TAG CAG CCG GAT TA-3’ 。
[0014]本发明的有益效果是:通过PCR给基因增加T7启动子和T7终止子，使其成为蛋白质的表达片段。该蛋白表达片段可被加入到大肠杆菌或其他细菌细胞提取物进行体外蛋白质表达；该方法高速、可高通量表达体外重组蛋白，尤其适合有毒蛋白。
【附图说明】
[0015]下面结合附图对本发明进一步说明。
[0016]图1是本发明的流程图。
【具体实施方式】
[0017]现在结合具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
[0018]实施例
[0019]生成组氨酸标记的多肽蛋白片段，建立多肽库以便用于抗原筛选。所有结核杆菌蛋白质均使用上述体外表达方法制备。
[0020](I)第一轮PCR反应:结核分支杆菌基因特异性引物组用PCR扩增每一个潜在的开放阅读框。引物1:如5’端序列:ACCATGCATCATCATCATCATCAT这24个碱基加上16?18个碱基的基因特异性序列。引物1:3’端序列:CGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATTA这24个碱基加上16?18个碱基的基因特异性序列。
[0021]制备DNA:根据TaKaRa PCR kit复制结核杆菌的开放阅读框。取genomic DNA20?50ug 进行 PCR 反应，PCR 反应体系:10X 缓冲液 2.5 μ 1，1mmoI/L dNTP 0.25 μ 1，5U/ μ ITaq DNA。
[0022]PCR 反应:94 °C 1min ； (94 °C Imin ;50_55 °C Imin ；72 °C 1.5min) X 30 循环；72°C 1min。
[0023](2)第二轮PCR反应:使用一个通用引物组扩增。第二轮PCR在5’端引入了噬菌体T7启动子，在3’端引入噬菌体T7终止子。来自前一步骤第一次PCR反应的DNA引入组氨酸标签和T7启动子片段和T7终止子片段的PCR反应。
[0024]基本PCR过程同第一步PCR反应。
[0025]启动子片段序列:5’-GATGCC GGC CAC GAT GCG TCC GGC GTA GAG GAT CGA GATCTC GAT CCC GCG AAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCA CAA CGG TTT CCC TCT AGAAAT AAT TTT GTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CCA TGC ATC ATC ATC ATC ATC AT-3’ 。
[0026]终止子片段序列:5’-GGCGAC CAC ACC CGT CCT GTG GAT ATC CGG ATA TAG TTCCTC CTT TCA GCA AAA AAC CCC TCA AGA CCC GTT TAG AGG CCC CAA GGG GTT ATG CTA GTTATT GCT CAG CGG TGG CAG CAG CCA ACT CAG CTT CCT TTC GGG CTT TGT TAG CAG CCG GATTA-3，。
[0027](3)第二轮PCR产物纯化后，添加体外大肠杆菌细胞提取物，并加入T7RNA聚合酶，该蛋白质合成反应在30°C过夜。
[0028]以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
【主权项】
1.一种新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法，其特征是:包括以下步骤: (1)第一轮PCR反应:使用基因特异性引物组，用PCR扩增每一个潜在的开放阅读框； (2)第二轮PCR反应:使用一个通用引物组扩增，在第二轮PCR反应中5’端引入了噬菌体T7启动子，在3’端引入噬菌体T7终止子，步骤(I)得到的PCR产物经第二步PCR后引入组氨酸和T7噬菌体启动子和终止子片段； (3)蛋白质合成:步骤(2)的PCR产物纯化后，添加大肠杆菌细胞提取物，并加入T7RNA聚合酶，在30°C过夜，进行无细胞体外蛋白质合成反应； (4)蛋白质纯化:组氨酸标记的蛋白是用镍涂覆的磁珠进行纯化。2.根据权利要求1所述的新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法，其特征是:所述的步骤⑴中采用基因特异性引物组包括引物I和引物2，引物1:5’端序列为若干个碱基加上16?18个碱基的基因特异性序列，引物2:3’端序列为与5’端相同数量个碱基加上16?18个碱基的基因特异性序列。3.根据权利要求1所述的新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法，其特征是:所述的步骤⑵中启动子片段序列:5’-GAT GCC GGC CAC GAT GCG TCC GGC GTA GAG GATCGA GAT CTC GAT CCC GCG AAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCA CAA CGG TTT CCCTCT AGA MT MT TTT GTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CCA TGC ATC ATC ATC ATC ATCΑΤ-3， 。4.根据权利要求1所述的新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法，其特征是:所述的步骤(2)中终止子片段序列:5’-GGC GAC CAC ACC CGT CCT GTG GAT ATC CGG ATA TAGTTC CTC CTT TCA GCA AAA AAC CCC TCA AGA CCC GTT TAG AGG CCC CAA GGG GTT ATG CTAGTT ATT GCT CAG CGG TGG CAG CAG CCA ACT CAG CTT CCT TTC GGG CTT TGT TAG CAG CCGGAT TA-3， o
【专利摘要】本发明涉及一种新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法，包括以下步骤：使用基因特异性引物组，用PCR扩增每一个潜在的开放阅读框；第二轮PCR反应在5ˊ端引入了T7噬菌体启动子，在3ˊ端引入T7噬菌体终止子，使用一个通用引物组扩增，得到的PCR产物含有组氨酸标签和T7噬菌体启动子片段和T7终止子片段的DNA；在无细胞反应体系中加入细菌提取物，进行体外蛋白质合成反应，随后采用磁珠法进行蛋白质纯化。本发明的有益效果是：通过PCR给基因增加T7噬菌体启动子和终止子，使其可以在体外成为蛋白质的表达片段。该方法可以快速、高通量表达体外重组蛋白，尤其适合有毒蛋白。
【IPC分类】C12N15/87, C12R1/19
【公开号】CN105018530
【申请号】CN201510383649
【发明人】徐东昕, 邓林红
【申请人】邓林红, 徐东昕
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月2日