一种利用线粒体dna鉴别牛羊肉中貂肉的lamp检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中貂肉的LAMP检测方法，属于分子生 物学检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 近年来随着市场对牛羊肉的需求逐渐增加及价格快速上涨，一些不法商贩在利益 的驱动下，掺加其他廉价肉造假冒充牛羊肉。2012年以来，国内曝光了多起以猪肉、鸡肉、鸭 肉冒充牛羊肉的事件。而在一些以皮毛为主的特种经济动物养殖地区，貂肉和狐狸肉的去 向成了一个谜，不少人推测其被掺入了牛羊肉中进入了人们的餐桌。这种现象不仅扰乱了 经济秩序，而且严重危害人们身体健康。
[0003] 目前，用于动物源性成分检测的方法主要有常规PCR、荧光定量PCR等，但上述诊 断方法花费时间较长，而且判定结果需要借助精密仪器设备，难以在实际生产中普及应用。
【发明内容】
[0004] 为了解决采用常规PCR、荧光定量PCR法检测牛羊肉中掺入貂肉所存在的上述技 术问题，本发明利用LAMP技术和动物线粒体DNA上细胞色素 C氧化酶亚单位I (COX I )基 因对貂肉进行鉴定，整个反应在恒温水浴锅中进行40min即可，而且可以通过在终产物中 加入染料的方法直接用肉眼观察结果。
[0005] 本发明的技术方案是： 一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中貂肉的LAMP检测方法，以待测肉品的DNA作为模 板、以DAF3、DAB3、DAFIP、DABIP为引物构建LAMP检测体系；LAMP检测体系于64°C恒温水 浴中反应40min，反应结束后向反应液中加入IuL荧光染料SYBR GREEN I ;若反应液变成 绿色，说明待测肉品中存在貂肉；若为橘黄色，则待测肉品中不存在貂肉； 所用引物如下： DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT，如 SEQ ID NO. 1 所示， DAB3:CATTTAGGGTGTAGCCTGTjnSEQIDN0.2K*， DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC，如 SEQ ID NO. 3 所示， DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC，如 SEQ ID NO. 4 所示； 所述LAMP检测体系，总体积为25uL ;其组成如下 lOumol/L 的 DAF3、DAB3 各 0· 5uL，10umol/L 的 DAFIP、DABIP 各 4uL，2. 5mmol/L 的 dNTP 4uL，50mmol/L 的 MgSO4 2uL，5mol/L 的 Betaine2. 5uL，Bst DNA 聚合酶 luL，IOXThermo buffer 2. 5uL，模板2uL，余量为超纯水。
[0006] 本发明的检测方法与传统PCR相比，在普通恒温水浴锅中反应40 min即可完成， 而且可以通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果，能快速准确地鉴定出动物 源性成分；具备操作简便、对实验仪器要求较低、结果判定容易的优点。本发明无需借助于 大型的昂贵仪器设备，更适合于基层的现地检测，具有广阔的市场前景和较大的社会经济 效益。
[0007] 本发明选用线粒体DNA上细胞色素 C氧化酶亚单位I (COX I )基因作为目的基 因；以DAF3、DAB3、DAFIP、DABIP为引物，能特异性地扩增貂肉COX I基因，从而将貂肉从 羊肉、牛肉中检测出来；且能够将其与猫、狐狸等相近种属的肉区分开来；具备特异性高的 优点。另外，采用DAF3、DAB3、DAFIP、DABIP为引物，其灵敏度高，所能检测到的最低浓度为 2X 10 4ng/uL ;因此，即使掺杂有微量貂肉也能被检测出来。
[0008] 本发明还提供了一种上述LAMP检测方法所用检测试剂，含有如下引物： DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT，如 SEQ ID NO. 1 所示， DAB3:CATTTAGGGTGTAGCCTGTjnSEQIDN0.2K*， DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC，如 SEQ ID NO. 3 所示， DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC，如 SEQ ID NO. 4 所示。
[0009] 本发明还提供了一种上述LAMP检测方法所用检测试剂盒，含有lOumol/L的DAF3、 DAB3 各 0· 5uL，lOumol/L 的 DAFIP、DABIP 各 4uL，2. 5mmol/L 的 dNTP 4uL，50mmol/L 的 MgSO4 2uL，5mol/L 的 Betaine2. 5uL，Bst DNA 聚合酶 luL，IOXThermo buffer 2. 5uL ; 其中： DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT，如 SEQ ID NO. I 所示， DAB3:CATTTAGGGTGTAGCCTGTjnSEQIDN0.2K*， DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC，如 SEQ ID NO. 3 所示， DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC，如 SEQ ID NO. 4 所示。
【附图说明】
[0010] 图I为实施例1检测结果图；从左向右顺序为：阴性对照，阳性对照，牛肉，羊肉， 狗肉，猫肉，狐狸肉，貂肉；结果显示：第2、8管为绿色，其余为橘黄色； 图2为PCR检测方法灵敏度示意图；从右向左顺序为：Marker，10 \ 10 2、10 3、10 4、10 5 稀释度； 图3为LAMP检测方法灵敏度示意图；从左向右顺序为：Marker，10 1UO 2、10 3、10 4、10 5 稀释度。
【具体实施方式】
[0011] 下述实施例中：所用试剂除由生产厂家直接提供的以外，其它均为分析纯；水，如 果没有特别说明，为超纯水。
[0012] 实施例1设计引物 从GenBank中检索获得貂的COX I序列，并进行软件比对分析，确定序列的准确性；根 据上述序列利用PrimerExplore软件设计引物如下： DAF3: GCTATGGGCCTTAGGGTT (如 SEQ ID NO. 1 所示）， DAB3: CATTTAGGGTGTAGCCTGT (如 SEQ ID 勵.2所示）， DAFIP:GTGAAGAACGATGTCTAGTGATGAGTTTTATTTACAGTGGGTGGC (如 SEQ ID 勵.3所示）， DABIP:GCACATTTTCACTACGTTCTTTCAAGGAACCAGTGAACGAATCC (如 SEQ ID 勵.4所示）。
[0013] 实施例2特异性实验 (1)提取样品DNA作为模板 严格无菌采集牛、羊、狗、猫、狐狸、貂的新鲜肌肉组织作为样品，然后采用酚氯仿提取 法分别提取样品中的DNA。分别以超纯水(阴性对照)，本实验室保存的含有貂肉COX I基因 的阳性质粒（阳性对照)，牛肉DNA，羊肉DNA，狗肉DNA，猫肉DNA，狐狸肉D