一种用于检测呼吸道病毒的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸扩增技术领域，涉及一种用于检测呼吸道病毒的试剂盒及其应 用。
【背景技术】
[0002] 呼吸道感染分为上呼吸道感染和下呼吸道感染，主要病原体包括细菌、病毒、支原 体、衣原体、真菌等，其中主要以病毒性感染为主，特别是上呼吸呼吸道感染中有80%以上 是病毒性的。该病四季、任何年龄均可发病，通过含有病毒的飞沫、雾滴，或经污染的用具进 行传播。常于机体抵抗力降低时，如受寒、劳累、淋雨等情况，原已存在或由外界侵入的病毒 或细菌，迅速生长繁殖，导致感染，成人一般5-7天痊愈。
[0003] 儿童感染呼吸道病原体通常诱发急性呼吸道感染（ARI)，ARI是婴幼儿、儿童常见 疾病，常继发支气管炎、肺炎、副鼻窦炎，少数可并发急性脑膜炎、心肌炎、肾炎、风湿热等， 并发症严重危害儿童的身体健康。已证实95%的ARI由细菌以外的病原体所致，病毒为ARI 主要病原体。不同年龄儿童对病毒易感性有所区别，据WHO数据显示，呼吸道感染是世界范 围内低龄儿童（〈5岁）死亡的首位原因，每年可造成约500万儿童死亡。儿童急性呼吸道感 染的患病次数平均为3-8次/年，在1岁儿童中感染的比例约1~3%，学龄儿童至5%~ 10%。由于各时期流行的病毒种类和型别不尽相同，有时少数几种不同病毒又可混合感染， 因此对儿童呼吸道病毒病原的监测有着非常重要的意义。早期快速诊断呼吸道病毒感染能 够及时指导临床治疗为合理选择抗病毒抗细菌药物提供依据并在防止抗生素滥用方面具 有重要意义。
[0004] 呼吸道病毒指能够侵染呼吸道或通过呼吸道进行传播的病毒，至少涉及到8个 科，200多种型别的病毒。临床常见的可导致呼吸道感染的病毒包括正粘病毒科的甲型流感 病毒（InfA)和乙型流感病毒（InfB)，副粘病毒科的副流感病毒1-3型（PIV1-PIV3)、呼吸 道合胞病毒（RSV)、人偏肺病毒（hMPV)，腺病毒科的腺病毒（AdV)、细小RNA病毒科的鼻病毒 (HRV)、冠状病毒（Corn)以及肠道病毒（Entv)等。目前检测常见呼吸道病毒的方法较多， 但都存在不足，如电镜检测方法复杂昂贵，病毒分离培养耗时极长且假阴性较多，在拿到培 养结果后通常已失去临床意义，酶联免疫法检测的是病毒特异性抗体但一次仅能检测一种 病毒。而基于核酸扩增的核酸检测，由于速度快（通常3小时内可完成检测）、灵敏度高、特 异性好，在病毒检测领域正逐渐成为金标准。
[0005] 依赖核酸序列的扩增技术（Nucleic Acid Sequence Based Amplification)，即 NASBA扩增技术，是由一对引物介导的、在体外特异性并连续均一的对单链RNA进行恒温扩 增的过程。在41°C恒温条件下，在反应速度方面，NASBA扩增Ih可将模板RNA扩增约IO 9~ 1〇12倍，而通常的PCR反应需要2~3h。在检测灵敏度方面，NASBA可以检测到溶液中低 于IOgene copies/μ 1的痕量革El标，而PCR的检测限在100gene copies/μ 1左右。因此， NASBA技术无论是扩增效率还是检测灵敏度都高于RT-PCR技术。而又由于NASBA的反应仅 需要一个41°C的恒温条件，水浴锅即可满足反应要求，不需要复杂的升降温等常规PCR所 依赖的温控设备，因此NASBA技术的仪器成本非常低廉。与相应的检测技术结合，NASBA还 具有操作简便、特异性强等诸多优点。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种用于检测呼吸道病毒的引物对组。
[0007] 本发明所提供的用于检测呼吸道病毒的引物对组，由如下16个引物对组成：
[0008] 由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对1 ;由序列表 中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对2 ;由序列表中序列5和序列6 所示的两条单链DNA分子组成的引物对3 ;由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA 分子组成的引物对4 ;由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA分子组成的引物对 5 ;由序列表中序列11和序列12所示的两条单链DNA分子组成的引物对6 ;由序列表中序 列13和序列14所示的两条单链DNA分子组成的引物对7 ;由序列表中序列15和序列16所 示的两条单链DNA分子组成的引物对8 ;由序列表中序列17和序列18所示的两条单链DNA 分子组成的引物对9 ;由序列表中序列19和序列20所示的两条单链DNA分子组成的引物 对10 ;由序列表中序列21和序列22所示的两条单链DNA分子组成的引物对11 ;由序列表 中序列23和序列24所示的两条单链DNA分子组成的引物对12 ;由序列表中序列25和序列 26所示的两条单链DNA分子组成的引物对13 ;由序列表中序列27和序列28所示的两条单 链DNA分子组成的引物对14 ;由序列表中序列29和序列30所示的两条单链DNA分子组成 的引物对15 ;由序列表中序列31和序列32所示的两条单链DNA分子组成的引物对16。
[0009] 其中，所述引物对I(InfAJT)用于扩增甲型流感病毒；所述引物对2 (InfAJll)用 于扩增甲型流感病毒Hl亚型；所述引物对3(InfA_H3)用于扩增甲型流感病毒H3亚型；所 述引物对4(InfB_TY)用于扩增乙型流感病毒；所述引物对5(RSV_TY)用于扩增呼吸道合胞 病毒；所述引物对6(HRV_TY)用于扩增鼻病毒；所述引物对7(ADV_TY)用于扩增腺病毒；所 述引物对8 (PIVl)用于扩增副流感病毒I型；所述引物对9 (PIV2)用于扩增副流感病毒II 型；所述引物对10 (PIV3)用于扩增副流感病毒III型；所述引物对11 (Corn_0C)用于扩增 冠状病毒HKU1/0C43 ;所述引物对12(Corn_NL)用于扩增冠状病毒229E/NL63 ;所述引物对 13(hMPV_TY)用于扩增人偏肺病毒；所述引物对14(Entv_TY)用于扩增肠道病毒；所述引物 对15(EV71_VP1)用于扩增肠道病毒EV71型；所述引物对16(CA16_VP1)用于扩增肠道病毒 CA16 型。
[0010] 本发明的第二个目的是提供一种用于检测呼吸道病毒的成套单链DNA。
[0011] 本发明所提供的用于检测呼吸道病毒的成套单链DNA，由探针组和所述引物对组 组成；所述探针组由如下16个单链DNA探针组成：序列表中序列33所示的单链DNA探针1 ; 序列表中序列34所示的单链DNA探针2 ;序列表中序列35所示的单链DNA探针3 ;序列表 中序列36所示的单链DNA探针4 ;序列表中序列37所示的单链DNA探针5 ;序列表中序列 38所示的单链DNA探针6 ;序列表中序列39所示的单链DNA探针7 ;序列表中序列40所示 的单链DNA探针8 ;序列表中序列41所示的单链DNA探针9 ;序列表中序列42所示的单链 DNA探针10 ;序列表中序列43所不的单链DNA探针11 ;序列表中序列44所不的单链DNA 探针12 ;序列表中序列45所示的单链DNA探针13 ;序列表中序列46所示的单链DNA探针 14 ;序列表中序列47所示的单链DNA探针15 ;序列表中序列48所示的单链DNA探针16。
[0012] 其中，所述单链DNA探针I (InfA_TY_MB)用于实时监测所述引物对1的扩增结果； 所述单链DNA探针2 (InfA_Hl_MB)用于实时监测所述引物对2的扩增结果；所述单链DNA探 针3 (InfA_H3_MB)用于实时监测所述引物对3的扩增结果；所述单链DNA探针4 (InfB_TY_ MB)用于实时监测所述引物对4的扩增结果；所述单链DNA探针5 (RSV_TY_MB)用于实时监 测所述引物对5的扩增结果；所述单链DNA探针6 (HRV_TY_MB)用于实时监测所述引物对6 的扩增结果；所述单链DNA探针7 (ADV_TY_MB)用于实时监测所述引物对7的扩增结果；所 述单链DNA探针8 (PIV1_TY_MB)用于实时监测所述引物对8的扩增结果；所述单链DNA探 针9(PIV2_TY_MB)用于实时监测所述引物对9的扩增结果；所述单链DNA探针10(PIV3_TY_ MB)用于实时监测所述引物对10的扩增结果；所述单链DNA探针11 (Corn_0C_MB)用于实 时监测所述引物对11的扩增结果；所述单链DNA探针12 (Corn_NL_MB)用于实时监测所述 弓丨物对12的扩增结果；所述单链DNA探针13 (hMPV_TY_MB)用于实时监测所述引物对13的 扩增结果；所述单链DNA探针14(Entv_TY_MB)用于实时监测所述引物对14的扩增结果；所 述单链DNA探针15 (EV71_VP1_MB)用于实时监测所述引物对15的扩增结果；所述单链DNA 探针16(CA16_VP1_MB)用于实时监测所述引物对16的扩增结果。
[0013] 所述探针组中的每条单链DNA探针的5'端均标记有荧光报告基团FAM，3'端均标 记有荧光淬灭基团TAMRA。
[0014] 在本发明所提供的所述成套单链DNA中，每个引物对及其对应的单链DNA探针可 单独包装在一个包装内。如所述引物对1和所述单链DNA探针1包装在第一个包装内；所 述引物对2和所述单链DNA探针2包装在第二个包装内；所述引物对3和所述单链DNA探 针3包装在第三个包装内；所述引物对4和所述单链DNA探针4包装在第四个包装内；所述 引物对5和所述单链DNA探针5包装在第五个包装内；所述引物对6和所述单链DNA探针 6包装在第六个包装内；所述引物对7和所述单链DNA探针7包装在第七个包装内；所述引 物对8和所述单链DNA探针8包装在第八个包装内；所述引物对9和所述单链DNA探针9 包装在第九个包装内；所述引物对10和所述单链DNA探针10包装在第十个包装内；所述引 物对11和所述单链DNA探针1包装在第^^一个包装内；所述引物对12和所述单链DNA探 针12包装在第十二个包装内；所述引物对13和所述单链DNA探针13包装在第十三个包装 内；所述引物对14和所述单链DNA探针14包装在第十四个包装内；所述引物对15和所述 单链DNA探针15包装在第十五个包装内；所述引物对16和所述单链DNA探针16包装在第 十六个包装内。
[0015] 本发明的第三个目的是提供一种用于检测呼吸道病毒的试剂盒。
[0016] 本发明所提供的用于检测呼吸道病毒的试剂盒，含有所述引物对组或所述成套单 链 DNA。
[0017] 所述试剂盒还可含有内对照引物对和内对照探针。所述内对照引物对为用于扩增 人基因组中管家基因 GAPDH mRNA的引物对GAPD_IC，由序列表中序列49和序列50所示的 两条单链DNA分子组成。所述内对照探针（GAPD_IC_MB)为序列表中序列51所示的单链 DNA探针，用于实时监测所述内对照引物对（GAPD_IC)的扩增结果。
[0018] 所述内对照探针的5'端标记有荧光报告基团FAM，3'端标记有荧光淬灭基团 TAMRA0
[0019] 所述试剂盒中还可含有恒温扩增缓冲液和恒温扩增酶溶液。
[0020] 所述恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：200mM pH 8.0的Tris-HCL， 50mM DTT，IOmM dNTP，IOmM