高通量转录组文库构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是基于分子生物学的基因组学检测技术，提供了 一种高通量测序转录组文库构建方法。
【背景技术】
[0002] 转录组是特定物种、组织或细胞类型转录的所有RNA(转录本）的集合。通过比 较转录组或基因表达谱的研究以揭示生物学现象或疾病发生的分子机制是高通量组学研 究的一个常用策略。利用高通量测序技术研究转录组在全面快速得到基因表达谱变化的 同时，还可以通过测定的序列信息精确地分析转录本的cSNP (编码序列单核苷酸多态性）、 可变剪接等序列及结构变异，另外对于检测低丰度转录本和发现新转录本具有其独特的优 势。目前转录组的研究方法主要包括基因芯片和二代测序，而基因芯片只能对已知物种的 转录组学研究，而二代测序则可以对已知和未知物种都可以做转录组学研究，基于第二代 测序技术的转录组测序，又称为RNA-Seq。
[0003] 转录组谱可以提供什么条件下什么基因表达的信息，并据此推断相应未知基因的 功能，揭示特定调苄基因的作用机制。通过这种基于基因表达谱的分子标签，不仅可以辨别 细胞的表型归属，还可以用于疾病的诊断。
[0004] 而转录组文库的构建，传统方法较为繁琐，步骤包括mRNA的分离，mRNA片段化，逆 转录成cDNA，双链合成，末端补齐，末尾加 A，加接头，PCR富集等步骤。同时对RNA的起始 量也有较高的要求，一般要求微克级别的总RNA。因此，在一定条件下限定了转录组的应用， 特别在一些单细胞转录组学研究，传统技术无法通过如此少量的RNA中构建文库。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种高通量转录组文库的构建方法，采用本发明 的方法RNA起始量可以做到ng级别，操作步骤比传统方法更简便。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种高通量转录组文库构建方法（如图1所 示）：
[0007] 逆转录生成单链cDNA时所用的特异性引物为带有polyT以及两段特异性序列的 引物，
[0008] 所述特异性引物为：3'-(T)16-TCTAGCCTTC TCGTGTGCAG-GTGCTGCGAG AAGGCTAGA-5' 〇
[0009] 作为本发明的高通量转录组文库构建方法的改进：
[0010] PCR富集时所用的两段特异性引物为：
[0011] 引物 F:
[0012] 5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCT A CA CGA CGCTCTTCCGA TCT 3' ；
[0013] 备注说明：其中斜体加下划线部分与"逆转录生成单链cDNA时所用的特异性引物 中的其中一段"互补；
[0014] 引物 R:
[0015] 5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATcgtgatGTGACTGGAGTTCA GACGTCTCKIXITCCG ATCT. .V.
[0016] 备注说明：其中斜体加下划线部分与"逆转录生成单链cDNA时所用的特异性引物 中的其中一段"相同，小写且下划线部分为高通量测序时用的barcode序列。
[0017] 作为本发明的高通量转录组文库构建方法的进一步改进：
[0018] 滚环扩增中所用的引物为：
[0019] RCA-F 引物 agatcggaagagcacacgtc
[0020] RCA-R 引物 agatcggaagagcgtcgtgt。
[0021] 作为本发明的高通量转录组文库构建方法的进一步改进，该方法包括以下步骤：
[0022] I)、mRNA 的分离：
[0023] 从总RNA中分离mRNA ;
[0024] 2)、mRNA 的片段化：
[0025] 将mRNA打碎成片段（为约180-300bp的片段）；
[0026] 3)、对片段化后的mRNA加 poly A尾：
[0027] 利用polyA聚合酶以及ATP，在片段化的mRNA的3'端加上碱基A(约为20-50个 喊基A);
[0028] 4)、逆转录生成单链cDNA :
[0029] 设计一条带有polyT以及两段特异性序列的引物（即，上文中所述的逆转录生成 单链cDNA时所用的特异性引物），与mRNA的polyA结合，并逆转录，加热变性后生成单链 cDNA ；
[0030] 5)、单链cDNA的环化：
[0031] 在单链DNA连接酶的作用下，单链cDNA环化，生成一个环；
[0032] 6)、PCR富集，文库构建：
[0033] 利用环上的两段特异性序列，设计两段特异性引物（即，上文中所述的PCR富集时 所用的两段特异性引物），通过一轮PCR，制备转录组文库。
[0034] 作为本发明的高通量转录组文库构建方法的进一步改进：
[0035] 在步骤5)和步骤6)之间补充如下的滚环扩增：
[0036] 通过环上的两段特异性序列（即，上文中所述的滚环扩增中所用的引物），利用 Phi29聚合酶，进行滚环扩增，从而生成1千到几万倍的含两段特异性序列的DNA单链。
[0037] 备注说明：该步为可选步骤，如果起始RNA量达到微克级，则可省略该步骤，如果 起始RNA量只有纳克级，则需要此步。
[0038] 本发明具体如下：
[0039] 步骤1)的mRNA的分离：
[0040] 真核生物的mRNA的3'端有polyA结构，因此可以利用带oligo (dT)的磁珠从总 RNA中分离mRNA ;
[0041] 步骤2)的mRNA的片段化：
[0042] 在mRNA中，加入片段化缓冲液，94°C 4分钟，将mRNA打碎成1约80-300bp的片 段；
[0043] 步骤3)的对片段化后的mRNA加 poly A尾：
[0044] 利用polyA聚合酶以及ATP，在片段化的mRNA的3'端加上约20-50个碱基A ;
[0045] 步骤4)的逆转录生成单链cDNA :
[0046] 设计一条带有polyT以及两段特异性序列的引物，与mRNA的polyA结合，并逆转 录，加热变性后生成单链cDNA。
[0047] 步骤5)的单链cDNA的环化：
[0048] 在单链DNA连接酶的作用下，单链cDNA环化，生成一个环。
[0049] 滚环扩增：
[0050] 该步为可选步骤，如果起始RNA量达到微克级，则可省略该步骤，如果起始RNA量 只有纳克级，则需要此步。通过环上的两段特异性序列，利用Phi29聚合酶，进行滚环扩增， 可以生成大量含两段特异性序列的DNA单链。
[0051] 步骤6)的PCR富集，文库构建。
[0052] 利用环上的两段特异性序列，设计两段特异性引物，通过一轮PCR，就制备成功转 录组文库。
[0053] 本发明具有如下技术优势：
[0054] 1、比传统的文库构建方法更为精简，传统方法需要mRNA分离，mRNA片段化，逆转 录，二链补齐，末端修复，加 A尾，加接头，胶回收，PCR富集等步骤。利用本发明的流程，可 以节省约一半时间；
[0055] 2、本发明的流程，可以对极低的RNA进行文库构建，传统方法需要几百纳克到几 个微克，而本方法可以对几个纳克的RNA进行文库构建，对RNA起始量要求比传统方法纸了 10-100 倍。
【附图说明】
[0056] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0057] 图1本发明构建二代测序文库的流程和原理图；
[0058] 图2为实施例1得到的转录组文库的电泳图；
[0059] 图3为实施例2得到的转录组文库的电泳图；
[0060] 图4为对比例1得到的转录组文库的电泳图；
[0061] 图5为对比例2得到的转录组文库的电泳图；
[0062] 图6为对比例3得到的转录组文库的电泳图。
【具体实施方式】
[0063] 实施例1、应用本发明，对小鼠肝脏来源的I yg的总RNA进行转录组建库。
[0064] 一、实验方法与步骤：
[0065] 1、mRNA的分离（以下试剂可从Invitrogen公司购得，货号：610-02)
[0066] 以1 μ g的总RNA起始，按照life公司官方操作说明进行mRNA的分离，见https:// www. lifetechnologies. com/cn/zh/home/references/protocols/nucleic-acid-purific ation-and-an alysis/mrna-protocols/dynabeads-oligo-dt-25. html#prot2〇
[0067] 用20 μ 1的无核酸酶的水溶解，得mRNA ;
[0068] 2、mRNA的片段化（以下试剂可从Ambion公司购得，货号AM8740)
[0069] 按以下体系加入试剂
[0070] IOX片段化缓冲液 2 μ L
[0071] mRNA 18 μ L
[0072] 混合均匀后，在PCR仪中94°C 2分钟，然后迅速置入冰上，并加入I yL 3Μ pH 5. 2 的醋酸钠溶液，2 μ L糖原（5ug/ μ L，Ambion公司，货号AM9510)，以及30 μ L无水乙醇，放置 于-80°C 30分钟。然后12000rpm离心30分钟，去上清，mRNA沉淀用11 μ L的无核酸酶的 水溶解；得片段化RNA ;
[0073] 此片段化 RNA 约为 180_300bp。
[0074] 3、mRNA加 polyA尾（以下试剂可从NEB公司购得，货号M076S)
[0075] 按以下体系加入试剂
[0076] 片段化RNA 1鄭 IOX缓冲液2pL ATP(iOmM) 聚合酶 1.HL
[0077] 总共20 μ L，混匀后于37°C 30分钟，并加入IOmM的EDTA终止反应，并用Qiagen的 DNA纯化试剂盒（Qiagen公司，货号28104)纯化，用11 μ L的水溶解，得加了 polyA的RNA ;
[0078] 此加了 polyA的RNA，是在片段化的mRNA的3'端加上约20-50个的碱基Α。
[0079] 4、逆转录（以下试剂可从invitrogen公司购得，货号18080-044)
[0080] 按以下体系加入试剂
[0081] 加了 polyA 的 RNA 10 μ L
[0082] 特异性引物 2 yL
[0083] 无核酸酶的水 2yL
[0084] 65 °C温育5分钟，然后放于冰