Sirt5调节剂及其筛选方法

Sirt5调节剂及其筛选方法
【专利说明】Sirt5调节剂及其筛选方法
[0001] 本申请是申请号为201180043047.0、申请日为2011年7月7日、发明名称为 "Sirt5调节剂及其筛选方法"的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为 PCT/US2011/043130的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2010年7月7日、申请号为 61/362, 078的美国临时申请的优先权。
[0002] 夺叉引用美国相关专利申请
[0003] 本发明要求美国临时专利申请的优先权（【申请号】N0. 61/362,078,申请日：2010 年7月7日），在此将其作为参考文献整体引用并到本发明中。
[0004] 关于美国联邦咨助研究的说明
[0005] 本发明得到美国政府的资助，获得NIH基金，合同号为GM086703。因此政府拥有本 发明的某些权利。
[0006] 发曰月背景
[0007] 沉默信息调控蛋白2(Sir2)或者叫去乙酰化酶（Sirtuins)，是一个具有辅酶 (nicotinamideadeninedinucleotide，NAD)依赖蛋白去乙酰活性的进化保守的酶家 族(A.A.Sauve,etal. ,Annu.Rev.Biochem. 75:435 (2006) ；S. -i.Imai,etal. ,Trends inPharmacologicalSciences31:212 (2010) ；M.C.Haigis,etal. ,AnnualReview ofPathology:MechanismsofDisease5:253(2010)).自从最初发现sirtuin的去乙 酰活性（S.-i.Imai，etal.，Nature403:795(2000) ;K.G.Tanner,etal.，ProcNatl. Acad.Sci.U.S.A. 97:14178(2000))，揭示了sirtuins的很多重要的生物功能，并且也很 好的理解了NAD依赖的去乙酰机制（S. _i.Imai，etal.，TrendsinPharmacological Sciences31:212 (2010) ；M.C.Haigis,etal. ,AnnualReviewofPathology:Mechanisms ofDisease5:253 (2010))。基于序列的相似性，sirtuins被分为不同的类型 (R.A.Frye,Biochem,Biophys.Res.Commun. 273:793 (2000))。哺乳动物有 7 种sirtuins， Sirtsl-7。Sirtsl-3属于第一类，Sirt4属于第二类，Sirt5属于第三类，Sirt6和Sirt7属 于第四类（R.A.Frye,Biochem.Biophys.Res.Commun. 273:793 (2000))。
[0008] 研究sirtuin活性的一个主要障碍在于7种人类sirtuins中的4种（Sirt4_7) 要么有非常弱的去乙酰活性，要么没有去乙酰活性（E.Michishita，etal.，Mol.Biol.Cell 16:4623(2005) ；M.C.Haigisetal.,Cell126:941(2006) ；A.Schuetzetal. ,Structure 15:377 (2007) ；G.Liszt,etal. ,J.Biol.Chem. 280 : 21323 (2005) ；E.Michishitaet al. ,Nature452:492(2008))。这对研究Sirtuins和开发调节他们活性的小分子带来了许 多困难。比如，由于没有强活性检测方法，所以难以开发以Sirts4-7为靶点的抑制剂或激 活剂。也难以确认以Sirtl、Sirt2和Sirt3为靶点的抑制剂或激活剂是否也同样作用于 Sirts4_7〇
[0009] 发明概沐
[0010] Sirt5, 一种线粒体去乙酰化酶，被发现是一种有效的脱丙二酰和脱琥珀酰酶。这 个发现证明了哺乳动物线粒体蛋白新的翻译后进行修饰的过程，即赖氨酸残基的丙二酰化 和琥珀酰化。Sirt5去除线粒体蛋白赖氨酸残基上的戊二酰，丙二酰和琥珀酰基团，这个过 程被认为可以可逆的调节线粒体蛋白的活性。由于发现了这个强酶活性，使得能够开发识 别Sirt5调节剂的方法。Sirt5特异性的调节剂可被用于研究Sirt5的生物功能和革巴向 Sirt5活性用于治疗人类疾病。
[0011] 附图简沐
[0012] 图1 :使用AMC-琥珀酰肽来测试Sirt5的荧光实验。
[0013] 图2A-2D:Sirt5的结构揭示了一个不寻常的酰基袋。（A)Sirt5的酰基袋被CHES 的缓冲分子与Argl05和Tyrl02相互作用产生的硫酸盐部分占据。所述硫酸酯距离硫代乙 酰基团4.2A。.⑶Sirt5-硫代乙酰肽结构和Sir2Tm-乙酰肽结构的对比。（C)理论预测丙二 酰/琥珀酰肽可能是Sirt5更好的底物。（D)Sirt5-琥珀酰肽-NAD三重结构表明琥珀酰基 团和Tyrl02和Argl05的相互作用。
[0014] 图3A-3F:Sirt5催化的丙二酰和琥珀酰赖氨酸的水解。纯化的去乙酰化酶（Sirtl 0. 75yM或Sirt5 3. 3yM)和0. 3mM的酰基肽一起孵育，1.OmMNAD加到含有ImMDIT的 60yL的 20mMTris-HCl缓冲液中（pH7. 5)，在 37°C反应 2 小时。反应用 60yL10%TFA 终止。去除沉淀的蛋白后，使用LCMS分析反应混合物。灰色曲线表明酰基肽的质量（乙 酰肽，m/z1274. 0 ;丙二酰肽，m/z1318. 0 ;琥珀酰肽，m/zl332. 0)和脱乙酰肽的质量（m/z 1232. 0)的离子峰强度（10x放大）。黑色曲线表明所有从100-2000的质量（总离子数或 者TIC)的离子峰强度。对于Sirtl，当H3K9乙酰肽（A)作为底物时可检测出脱乙酰产物， 当使用H3K9丙二酰（B)和琥珀酰（C)肽时没有水解产物被检出。对于Sirt5,脱乙酰产物 很少被检出（D)，而脱丙二酰（E)和脱琥珀酰（F)产物可以被检出。
[0015] 图4A-4B:(A)琥珀酰赖氨酸残基存在于牛肝脏线粒体中。使用32P-NAD可以 检出Sirt5催化的丙二酰和琥珀酰肽的水解，形成32P标记的0-Ma-ADPR(条带2)和 0-Su-ADPR(条带3)。用乙酰肽则没有反应发生（条带1)。当组蛋白被用作乙酰赖氨酸 (条带8)或H3K9乙酰肽（条带4)的来源时，Sirtl催化的0-Ac-ADPR的形成可以被检测 出来。当用32P_NAD和Sirt5孵育被胰蛋白酶消化的牛肝脏线粒体肽时形成0-Su-ADPR(条 带9)，但用Sirtl则不能形成（条带10)，这表明琥珀酰赖氨酸残基存在于牛肝脏线粒体肽 提取物中。作为对照组的用BSA肽和Sirt5的反应不会产生0-Su-ADPR(条带12)。⑶38 能水解NAD产生ADPR，它被用来产生在第13条带上的标准32P-ADPR点。（B)Sirt5的缺失 可以增加老鼠肝脏部位的CPS1琥珀酰水平。在野生型或Sirt5敲除的肝脏中免疫沉淀出 CPS1，用32P-NAD检测出琥珀酰化水平。合成的乙酰，丙二酰和琥珀酰肽可被用来分别产生 对照点 0-Ac-ADPR，0-Ma-ADPR和 0-Su-ADPR。
[0016] 图5A-5C:Sirtl和Sirt5催化的H3K9肽㈧脱乙酰化，⑶脱丙二酰化和（C)脱 琥珀酰化通过HPLC被检测（检测波长为215nm)。一个更长的HPLC柱被用于更好地分离酰 基肽和脱酰基肽。结果进一步表明Sirtl有更好的脱乙酰活性，而Sirt5有更好的脱丙二 酰和脱琥珀酰活性。
[0017] 图6A-6B: (A)表示Sirtuin催化的NAD依赖的脱酰基化反应，这个反应产生0-酰 基-ADP-核糖。（B)sirtuin催化的NAD依赖的脱乙酰基化的机理。
[0018] 图7A-7D :0-丙二酰-ADPR的⑷和0-琥珀酰-ADPR⑶的HPLC纯化及MS确认 (C和D)。在A和B中的黑色曲线是Sirt5催化的H3K9酰基肽脱丙二酰化和脱琥珀酰化 的HPLC曲线（检测波长为260nm)。用Sirtl孵育的肽没有产生相同的产物（灰色曲线）。 o-丙二酰-ADPR(C)和0-琥珀酰-ADPR(D)进一步通过MALDI-MS分析。0-丙二酰-ADPR和0-琥珀酰-ADPR的形成表明Sirt5催化的反应机制和第一类的脱乙酰化酶的脱乙酰化 机制相同。
[0019] 图8 :Sirt5催化的脱丙二酰和脱琥珀酰反应。
[0020] 图9 :受保护的硫代琥珀酰赖氨酸化合物的合成，被用于制备H3K9TSu肽。
[0021] 图10 :AMC-琥珀酰肽的合成。
[0022] 图11:ISGASE(SuK)-AMC是Sirt5的底物。ISGASE(SuK)-AMC肽在有或没有Sirt5 下孵育4小时，然后加1yg胰蛋白酶孵育3小时。与没有Sirt5的阴性对照相比，1，2,和 5以1的31竹5使荧光分别增加11，20，和26倍。
[0023] 图 12 :SGASE(SuK)-AMC不是Sirtl，2,和 3 的底物。ISGASE(SuK)-AMC肽用 1yM 不同的去乙酰化酶孵育4小时，然后用1yg胰蛋白酶孵育3小时。与没有去乙酰化酶的阴 性对照相比，只有使用Sirt5的荧光才增强。
[0024] 图13:使用荧光底物ISGASE(SuK)-AMC筛选Sirt5抑制剂。没有Sirt5和有Sirt5， 但是不加小分子的反应做对照组。所有小分子的浓度为30yM。H3K9TSu和suramin表现 出显著的Sirt5抑制活性。
[0025]图 14 :ISGASE(AcK)-AMC是Sirt2 底物。ISGASE(AcK)-AMC肽用 1yM不同的去乙 酰化酶孵育10小时，然后加入1yg胰蛋白酶孵育3小时。与没有去乙酰化酶的阴性对照 相比，Sirt2增强荧光最多，但Sirt5和Sirt3没有显著增强荧光。
[0026] 图15:使用ISGASE(AcK)-AMC和Sirt2筛选发现H3K9TSu而不是苏拉明 (suramin)是Sirt5特异性的抑制剂。

【发明内容】

[0027] 去乙酰化酶（Sirtuins)是一类进化保守的酶，与很多生物功能有关。Sirtsl-3被 认为有强的脱乙酰活性，但是在本发明公开之前，Sirts4-7没有被发现有强的酶活性。比 如，Sirt5的脱乙酰活性弱，其脱乙酰的效力比Sirtl低500倍。
[0028] 本发明第一次发现Sirt5对丙二酰和琥珀酰肽比对乙酰肽具有更显著的水解活 性。进一步说，本发明表明在哺乳动物细胞中存在蛋白赖氨酸琥珀酰化和丙二酰化。另外， 在Sirt5敲除的小鼠组织中，观察到CPS1 (-个已知的Sirt5靶蛋白）的赖氨酸琥珀酰化水 平增高。因此，可以认为Sirt5在体内的主要活性是脱琥珀酰和脱丙二酰，而不是脱乙酰。
[0029] 本发明的研究者发现了Sirt5的强酶活性，使开发鉴别Sirt5特异性调节剂的方 法成为可能。Sirt5特异性调节剂可被用于研究Sirt5的生物功能，可以祀向Sirt5活性用 于治疗人类疾病。
[0030]Sirt5 活性
[0031] 本发明中使用的"Sirt5活性"包括酶去除赖氨酸残基上的酰基（丙二酰，琥珀酰， 戊二酰和乙酰）。所以，Sirt5活性包括赖氨酸残基的脱丙二酰，脱琥珀酰，脱戊二酰和脱乙 酰。
[0032] 在本发明的一些实施例中，公开了Sirt5独特的脱琥珀酰和脱丙二酰活性。 "Sirt5脱琥珀酰活性"是指Sirt5酶去除赖氨酸残基上的琥珀酰基。"Sirt5脱丙二酰活 性"是指Sirt5酶去除赖氨酸残基上的丙二酰基。
[0033]Sirt5能作用于孤立的带有酰基的赖氨酸残基，或者是作用于在肽或蛋白中的酰 基化的赖氨酸残基。Sirt5活性，比如，脱琥珀酰和脱丙二酰活性可以发生在体内作为对含 有琥珀酰或丙二酰赖氨酸的蛋白翻译后进行修饰，使得下游生理反应的产生。
[0034] "Sirt5调节剂"或"Sirt5调控剂"或"Sirt5调控化合物"是可以激活或抑制Sirt5 活性的底物。"Sirt5抑制剂"是可以降低或阻止Sirt5活性的底物。"Sirt5激活剂"是可 以提尚或促进Sirt5活性的底物。
[0035] 检测Sirt5活性的方法
[0036] 一方面，本发明公开了一种在样本中检测Sirt5脱丙二酰，脱琥珀酰或脱戊二酰 活性水平的实验。
[0037] 上述实验基于含有丙二酰，琥珀酰，或戊二酰赖氨酸的底物。所述赖氨酸连接指示 剂部分，所述赖氨酸和指示剂部分间的连接可以被裂解剂裂解，所述裂解剂对赖氨酸残基 的丙二酰化，琥珀酰化或戊二酰化状态敏感。因此，当所述底物在能被Sirt脱丙二酰化，脱 琥珀酰化或脱戊二酰化的环境下与Sirt5接触时，酰基的去除（可能导致裂解部位的暴露） 允许裂解剂作用于裂解部位，然后释放指示剂部分，产生可检测的信号。
[0038] 用于在实验中检测Sirt5活性的合适底物可以是任何含有琥珀酰，丙二酰或戊二 酰赖氨酸残基的分子，包括孤立的赖氨酸残基或者是含有赖氨酸的肽。在具体的实施例中， 用于实验的底物是含有琥珀酰或丙二酰赖氨酸残基的肽，并连接有指示剂部分。
[0039] 本发明所使用的术语"肽"包括通过肽键相连的2个或者更多氨基酸。对肽的链长 没有特别限制。所述肽链短到可以是4到5个氨基酸，也可以长到50个氨基酸或者更长。 在一些实施例中，被用于方法的肽的长度是15到25个氨基酸。除了肽一般在C端包括琥 珀酰，丙二酰或戊二酰赖氨酸外，对肽的氨基酸序列也没有特别的限制。优选的，所述肽底 物在丙二酰或琥珀酰赖氨酸残基之前没有赖氨酸或者精氨酸残基，这样一旦去除琥珀酰或 丙二酰基，在琥珀酰或丙二酰赖氨酸和指示剂部分间的连接（比如酰氨键）可以被裂解剂 有效地作用。在一个具体实施例中，所述肽链具有序列异亮氨酸-丝氨酸-甘氨酸-丙氨 酸-丝氨酸-谷氨酸-赖氨酸（ISGASEK，SEQIDN0:1)，其中所述的赖氨酸是酰化的（琥珀 酰化，丙二酰化或戊二酰化）。
[0040] 不管是孤立的还是作为肽的一部分，所述丙二酰，琥珀酰或戊二酰赖氨酸和指示 剂部分连接。所述连接是共价连接，在赖氨酸的酰基被去除后可以被裂解剂裂解。比如，所 述共价连接是一个酰胺键，形成于丙二酰，琥珀酰或戊二酰赖氨酸羧基和指示剂化合物的 氨基之间，在赖氨酸的酰基被去除后（比如，导致所述肽键向蛋白水解酶暴露）易被蛋白水 解酶裂解。
[0041] 所述裂解剂可以是任何能可预见性地裂解在特定氨基酸残基之间肽的试剂（比 如蛋白水解的裂解方式），但是在赖氨酸被琥珀酰化，丙二酰化或者戊二酰化时不能裂解肽 键。如一个实施例所述，裂解剂是蛋白水解酶，比如可以水解肽键的酶（也指肽酶）。所述 的蛋白水解酶包括但不限于胰蛋白酶，钙蛋白酶，赖氨酰肽链内切酶，赖氨酸-C蛋白内切 酶，金属肽链内切酶，血纤维蛋白溶酶，羧肽酶，胰凝乳蛋白酶，V8蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋 白酶，枯草杆菌蛋白酶，凝血酶，弹性蛋白酶，gluc_C，endolys-C或者蛋白酶K，半胱天冬 酶-1，半胱天冬酶-2,半胱天冬酶-3,半胱天冬酶-4,半胱天冬酶-5,半胱天冬酶-6,半胱 天冬酶-7,半胱天冬酶-8,MetAP-2,腺病毒蛋白酶，HIV蛋白酶等。
[0042] 在一个具体的实施例中，所述裂解剂是胰蛋白酶。胰蛋白酶水解肽键，所述肽键的 羧基来自赖氨酸和精氨酸残基；因此，胰蛋白酶可以裂解Sirt5底物的赖氨酸残基的羧基 末端的肽。另外一种合适的裂解剂是胃蛋白酶，它能水解在丙基苯氨酸，色氨酸和酪氨酸残 基的氨基末端的肽键。因此，所述胃蛋白酶可以裂解赖氨酸残基和邻近的丙基苯氨酸，色氨 酸或酪氨酸残基之间的底物肽。
[0043] 在这些实验中，Sirt5酶活性是通过蛋白水解消化，用裂解剂从肽上裂解指示剂部 分，产生一个可检测的信号。
[0044] "指示剂部分"是能检测到Sirt5活性的分子或Sirt5底物的组分。指示剂部分或 许可以是，比如，荧光或其他标记分子，比如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC)，FLAG，或聚组氨 酸抗体标签。在具体实施例中，所述指示