利用噬菌体抗体库针对人组胺受体4(hr4)表位模拟肽筛选及其疫苗构建方法

文档序号:9318755阅读:695来源:国知局
利用噬菌体抗体库针对人组胺受体4(hr4)表位模拟肽筛选及其疫苗构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药生物技术领域,具体涉及一种用噬菌体抗体库针对人组胺受体 4(HR4)表位模拟肽筛选及其疫苗构建方法。
【背景技术】
[0002] HR4分子及其诘抗剂的相关研究HR4分子组胺受体-4(histamine receptor-4,HR4)是一种新发现的组胺受体,为跨膜G蛋白親连受体(G-protein-coupled receptors,GPCRs),功能在于抑制腺苷酰环化酶活性,活化磷酸蛋白酶C(phospholipase C)和诱导钙离子流动。HR4优先分布于免疫器官和造血细胞上,涉及到变应性鼻炎(allergicrhinitis,AR)的病理性免疫应答的所有免疫细胞。肥大细胞、CD4+T、CD8+T细 胞、嗜酸性粒细胞、NK细胞、树突细胞、单核细胞都可以检测到HR4的表达,并被证明具有 介导免疫调节功能。2.HR4拮抗剂HR4拮抗剂对TLR配体诱导树突细胞的活化过程产生的 IL-6、KC、MIP-a和IP-10等细胞因子和趋化因子表现为抑制作用,HR4的拮抗剂、负性激 动剂已经在体外实验中获得了很好的抗炎前景。体外研究发现当HR4信号途径无作用的 时候,在抗原刺激过程时,IFN-y和特异性IgG2a均不增加,而且炎性细胞因子IL-6和 IL-17A也都表现为被抑制。这说明针对HR4信号途径的治疗在抑制Th2细胞应答时,机体 内的微环境并不向Thl类过度反应偏离,体内微环境处于相对稳定状态。JNJ-7777120是 第一个,有效的,选择性非咪唑histamineH4receptor诘抗剂,Ki为4. 5nM,比作用于其他 组胺受体选择性高1000倍以上,其作用表现在嗜酸性粒细胞的趋化,肥大细胞的趋化以及 变应性鼻炎及变应性气道炎症,并在变应性鼻炎皮炎动物模型获得良好的治疗作用。JNJ 7777120具有口服生物利用度,处理大鼠为30%,处理犬为100%,处理这两个品种的半衰 期都为3小时。JNJ7777120处理小鼠骨髓衍生的肥大细胞,抑制组胺诱导的趋化性和钙 流入。JNJ7777120处理小鼠,抑制组胺诱导的气管肥大细胞从结缔组织向上皮细胞的迀 移。JNJ-7777120为化学合成,价格昂贵,3030RMB/50mg,存在口服生物利用度,对肝肾影响 尚未明确。
[0003] 菌体展示技术(PhageDisplayTechnology)是一项特异性多肽或蛋白的筛选 技术,1985年由美国Missouri大学G.P.Smith等首创,此技术可将目的基因编码的多肽以 融合蛋白的形式展示于噬菌体表面,被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和 生物活性,使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系,使得各种靶分子(如抗 体、酶和细胞表面受体等)的多肽配体通过体外亲和淘选程序得以快速鉴定。噬菌体展示 技术已被广泛用于肿瘤诊断标志物和抗肿瘤先导化合物的筛选、肿瘤特异性抗体和肿瘤药 物靶向运输等方面的研究。
[0004] 噬菌体展示技术正逐步发展成熟,为获取对癌症诊断和治疗有价值的多肽或抗体 提供了重要手段。目前已发现多种与肿瘤相关的基因和抗原,肿瘤相关配体和多肽的筛选 已成为寻找抗肿瘤药物的新热点,针对肿瘤细胞不同表达分子的特异性结合多肽,为肿瘤 治疗提供了新的靶点,也为放射标记的肿瘤检测、化疗药物的给药、药物敏感实验及肿瘤的 免疫治疗提供了新的分子靶位,噬菌体多肽还具有抑制肿瘤相关基因转录、阻碍肿瘤新生 血管生成和转移及诱导肿瘤细胞凋亡等作用,将多肽与脂质体或纳米药物偶联,既有助于 在达到更好的靶向治疗效果,又减小了药物的毒副作用,还可用于肿瘤血管三维成像和分 子影像技术的检测及肿瘤治疗疗效评价。

【发明内容】

[0005](一)解决的技术问题
[0006] 针对现有技术的不足,本发明提供一种HR4表位模拟肽及其筛选方法,本发明利 用噬菌体随机十二肽库技术筛选HR4表位模拟肽的多肽序列,ELISA鉴定噬菌体单克隆对 HR4单抗的亲和力,获得30个噬菌体克隆,测序获得1条多肽序列,筛选获得的人HR4单克 隆抗体特异性多肽,进而构建HR4表位模拟肽疫苗。
[0007](二)技术方案
[0008] 为实现以上目的,本发明通过以下技术方案予以实现:
[0009] -种HR4表位模拟肽,利用噬菌体随机十二肽库筛选得到多肽片段,其氨基酸序 列分别为:FNKWMDCLSVTH。
[0010]HR4表位模拟肽的筛选方法,包括以下步骤:
[0011] SI、HR4单克隆抗体IgG纯化,用pH值为6. 9~7. 1的20mmol/L磷酸缓冲液稀释 HR4单克隆抗体,并包被ELISA板;
[0012] S2、用封闭缓冲液室温封闭,用TBS和Tween20的混合液进行洗涤;
[0013]S3、向包被有单克隆抗体的微孔中加入筛选用噬菌体,缓慢振摇,使噬菌体与包被 抗体充分接触,用TBS和Tween20的混合液洗涤去除未结合的噬菌体;
[0014]S4、用甘氨酸-盐酸缓冲液室温洗脱结合的噬菌体,中和液中和后在宿主菌大肠 杆菌ER2738中扩增噬菌体,作为下一轮筛选的投入物,同时测定洗脱物和投入物的滴度;
[0015]S5、重复上述步骤共进行三轮筛选,从第三轮筛选后的洗脱物滴定平板中随机挑 选30个噬菌体克隆,进行噬菌体ELISA、噬菌体微筛选,得到本发明物。
[0016] 优选的,步骤S1中所述磷酸缓冲液pH为7. 0。
[0017]优选的,步骤S4所述甘氨酸-盐酸洗脱缓冲液pH为2. 7。
[0018]HR4表位模拟肽疫苗的构建方法,包括以下步骤:Sl、HRH4的模拟表位PT1 的人工合成,按照上述的多肽表位氨基酸序列结果,采用固相合成法合成多肽表位 PT1 (FNKWMDCLSVTH)合成由辉源生物科技(上海)有限公司,纯度为98%以上,同时合成对 照多肽;
[0019]S2、PT1与HRH4单抗特异性结合实验,以2mg/LPT1和对照多肽包被96孔酶联板, 每孔100y1,4°C孵育过夜,倾去包被液,于每孔中加入封闭液,4°C封闭2h,倾去封闭液, TBST洗6次,每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上,轻扣除尽残余液体,将人HRH4单克 隆抗体,人CEA单克隆抗体分别加入对应的孔中,室温反应lh,TBST洗6次,各孔分别加入 HRP标记羊抗兔IgG或HRP标记羊抗鼠IgG,室温孵育lh。TBST洗3次,lmin/次,用TMB显 色,HC1终止反应,酶标仪450nm处读数;
[0020] 33、构建?!1-〇^-脂质体复合物,以0.9%无菌氯化钠溶液溶解多肽和〇^,然后 加入相同体积的脂质体Lipofect,使每200y1含多肽100yg,含CTB5yg,4°C静置过夜, 次日晨取出,升至室温(25°C),即可。
[0021 ] 优选的,所述HR4表位模拟肽疫苗用于治疗应变性的过敏性疾病。
[0022] (三)有益效果
[0023] 本发明利用噬菌体随机十二肽库技术筛选HR4表位模拟肽的多肽序列,ELISA鉴 定噬菌体单克隆对HR4单抗的亲和力,获得30个噬菌体克隆,测序获得1条多肽序列,命名 为PT1,进一步鉴定噬菌体阳性克隆的靶向性结果提示噬菌体阳性克隆能够特异性结合人 HR4单克隆抗体,而不与人CEA单抗和BSA结合,筛选获得的人HR4单克隆抗体特异性多肽, 进而构建HR4表位模拟肽疫苗,本发明HR4模拟表位为基础的疫苗,将会在临床的变应性鼻 炎治疗,及HR4拮抗剂的研制方面打下良好的基础,为其构建工作提供初步的实验依据。
【附图说明】
[0024]图1、随机十二肽pIII融合蛋白的N末端序列;
[0025] 图2、噬菌体12肽库与HR4单克隆抗体各轮筛选产物滴度,其中A:第一轮稀释102 倍测滴度约1. 2x104pfu;B:第二轮稀释103倍测滴度,约2. 7x105pfu;C:第三轮稀释104 倍测滴度,约3. 9xl06pfu;HR4单克隆抗体特异性结合噬菌体出现了有效富集。
[0026] 图3、Elisa检测第三轮筛选噬菌体克隆与HR4单克隆抗体的亲和力:横坐标1,2, 3,…,30分别代表菌体克隆phage-1,phage-2,phage-3,…,phage-30。Con代表随机对 照克隆。
[0027] 图4、Elisa检测噬菌体克隆与HR4单克隆抗体的亲和力。
[0028] 图5、阳性噬菌体克隆与HR4单抗特异性结合的分析。
[0029] 图6、ELISA检测血清与HR4的结合结果分析图。
[0030] 图7、ELISA检测血清中IFN-r,IL-2,IL-6表达水平结果分析图。
[0031] 图8、Real-timePCR检测血细胞中IFN-r,IL-2,IL-6表达水平结果分析图。
[0032] 图9、ELISA检测支气管灌洗液与HRH4的结合结果分析图。
[0033] 图10、Real-timePCR检测黏膜组织中IFN-r,IL-2,IL-6表达水平结果分析图。
[0034] 图11、Western-blotting检测黏膜组织中IFN-r,IL-2,IL-6表达水平结果分析 图。
【具体实施方式】
[0035] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例, 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部 分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作 出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
[0036] 一、主要实验材料
[0037] ⑴革巴分子:Anti_HR4antibody(abl78704)单克隆抗体前期进行了ProteinA/G纯 化,得到高纯度的(>95% )可用于噬菌体肽库筛选的单克隆抗体。
[0038] ⑵菌体肽库:菌体随机十二肽库(Ph.D-12TMphagedisplaypeptide li
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