拟南芥抗性基因cimt1、其编码蛋白及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及拟南芥抗性基因cnm、其编码蛋白及应 用。
【背景技术】
[0002] 目前，世界上的许多耕地都有轻度的重金属污染，这些重金属污染物主要有镉、 铜、锌、镍、钴、铅、砷等。这些重金属污染主要是由于长期使用磷酸肥料、污水处理不利、工 业废料的污染、农业灌溉的不科学造成的。植物体在面对这些重金属胁迫时一方面会产生 活性氧（R0S)。在植物中，大多数金属产生活性氧（R0S)是重金属毒性的间接作用结果。这 种间接的作用包括它们与抗氧化系统的反应，扰乱电子传递链，或者扰乱新陈代谢的必需 元素的合成。植物体中，重金属胁迫所造成的另一个较严重的结果就是脂质的过氧化，这种 脂质的过氧化可以导致生物膜的损伤。丙二醛（MDA)是生物膜中多不饱和脂肪酸的一种重 要的分解产物，可以用来作为生物膜氧化胁迫的指示剂。重金属会导致植物体出现很多的 病症。以镉为例，镉（Cd)是一种高毒性的重金属。镉处理会抑制植物的很多生理过程，比 如光合作用、细胞延长、固氮和矿物营养吸收等。耕地中镉的正常含量不能超过l〇〇mg/kg。 植物体处于镉胁迫时，就会出现光合效率降低、水分吸收降低以及营养吸收降低等性状。植 物在含有过多的隔的土壤中，会出现萎黄病、生长抑制并最终导致植物体死亡。
[0003] 玉米（学名：Zea mays)是重要的粮食作物和饲料来源，也是全世界总产量最高的 粮食作物，目前也是我国种植面积最大的农作物。现代科技条件下，玉米深加工被广泛应用 于食品工业，医药工业和化学工业，具有广阔的应用前景。但是，随着耕地污染的加重，各种 主要的农作物的产量，包括玉米在内都受到严重的影响。所以，研究玉米中的抗性基因及其 功能，对于提高玉米以及其他粮食作物的增产具有重大意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供拟南芥抗性基因cnm、其编码蛋白及应用。
[0005] 本发明所采取的技术方案是：
[0006] 拟南芥cnm蛋白或其编码基因或含有该编码基因的重组载体、重组菌、转基因 细胞系、转基因植物株系在培育抗逆植物中的应用，其中，所述拟南芥cnm蛋白如seqid NO. 6所示，或者是SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基 酸和/或修饰后且具有提尚植物抗逆功能的序列。
[0007] 拟南芥CIMT1蛋白或其编码基因在抗逆植物辅助育种中的应用，其中，所述拟南 芥cnm蛋白如EQ ID N0. 6所示，或者是SEQ ID N0. 6所示的氨基酸序列经取代、缺失和 /或增加一个或多个氨基酸和/或修饰后且具有提高植物抗逆功能的序列。
[0008] 所述抗逆包括抗重金属污染、抗氧化胁迫、抗高温胁迫、抗低温胁迫、抗盐碱、抗 旱、抗病虫害中的至少一种。
[0009] 所述重金属包括镉、汞、金、银、铜、铁、铅、砷、铬中的至少一种。
[0010] 一种抗逆植物的培育方法，包括将拟南芥cnm基因转入受体植物中，得到转基 因植物；所述转基因植物与受体植物相比，其对逆境的抗性提高；所述拟南芥cnm基因的 核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示，或者为SEQ ID N0. 5的同义密码子突变序列。
[0011] 所述逆境包括：重金属污染、氧化胁迫、高温、低温、高盐碱、干旱、病虫害中的至少 一种。
[0012] 所述重金属包括镉、汞、金、银、铜、铁、铅、砷、铬中的至少一种。
[0013] 拟南芥B0XS2顺式作用元件或其激活剂在培育抗逆植物中的应用。
[0014] 本发明的有益效果是：
[0015] 本发明在拟南芥中克隆了镉抗性基因cnm，它可以被cd所大量诱导，表达过量 的cnm足以使拟南芥产生抗cd的表型，这说明cnm在重金属的抗性调控中起到重要的 作用。因此，CIMT1基因具有极大的潜力应用于培育具有抗镉特性的转基因作物中，从而提 高粮食作物的产量。
【附图说明】
[0016] 图1为Zm0XS2b与Zm02Ll基因PCR产物的1 %的琼脂糖凝胶电泳图。
[0017] 图2为玉米中Zm0XS2b与Zm02Ll的基因结构示意图（蓝色长方型：ANKYRIN重复 序列；红色长方形：锌指结构域；绿色方框：多聚谷氨酰胺序列；倒三角：预测出核序列；黑 色长条:AT3片段；所有蛋白编码区中并不存在内含子。数字表示从转录起始位点开始的 DNA基因组位置）。
[0018] 图3为qRT-PCR检测的Zm0XS2b与Zm02Ll的相对表达量（生长15天的玉米植株 使其处于0或者200 y M CdCl2处理下，误差线表示三次独立实验的标准偏差）。
[0019] 图4为滴板检测Zm0XS2b，Zm02Ll、AT3片段在粟酒裂殖酵母中的组成型表达（用 转化空载体的酵母作为负对照，三角形表示，浓度依次十倍稀释）。
[0020] 图5为拟南芥种子种植在水平放置的1/2MS与含有75 y M CdCl2浓度的1/2MS培 养基上11天（每种转基因植株的三个独立的转基因株系被用来检测）。
[0021] 图6为生长在1/2MS与含有75 yM 0(1(：12的1/2MS培养基上11天的拟南芥幼苗 (5棵）的鲜重（每个株系不少于20棵幼苗被用来测量，误差线表示三次独立重复实验的标 准偏差）。
[0022] 图7为拟南芥种子种植在竖直放置的1/2MS与含有75 y M CdCl2浓度的1/2MS培 养基上11天（每种转基因植株的三个独立的转基因株系被用来检测）。
[0023] 图8为差异表达基因的韦恩图（括号上的蓝色数字表示上调的差异基因，括号下 的黑色数字表示下调差异基因，括号中的数字是某一部分差异基因的总量，括号旁边的紫 色的数字表示一个基因在C1部分中下调，但是在C2部分中上调）。
[0024] 图9为Cl、C2中差异基因交集聚类分析的热图（表达的差异用log2的值表示。 红色表示与对照样品相比上调的基因，绿色表示与对照样品相比下调的基因）。
[0025] 图10为8个差异基因的表达情况（柱状图表示转基因植株与野生型转录水 平的差异倍数，误差线代表三次独立实验的标准偏差；Student' s t test的P值：胁 迫处理的样品与非胁迫处理的样品的比较；a:0. 01〈P < 0. 1 ;b :0. 001〈P < 0. 01 ;c : 0? 0001〈P < 0? 001) 〇
[0026] 图11为Zm0XS2b与Zm02Ll蛋白激活含有B0XS2的启动子，蛋白质与启动子的互 作检测图（侵染两天之后检测荧光强度LUC与rLUC的比值；黑色方框：预测的B0XS2序列； 数字：相对于转录起始位点的DNA序列位置；B0XS2上方的数字：每个B0XS2的起始核苷酸 位置；误差线：三次独立重复实验的标准偏差）。
[0027] 图12为转基因植物WT(DEGs)与野生型的相对表达量的对比（含有8个不同的 DEGs的35S: :DEG重组载体分别转入野生型中，每种转基因植物中的3个独立的株系在 1/2MS培养基中生长11天，纵坐标表明了这些差异基因在转基因植物中的相对表达量相比 与在野生型中表达量的倍数，误差线表示两次技术重复的标准偏差）。
[0028] 图13为拟南芥种子种植在水平放置的1/2MS与含有75 y M CdCl2浓度的1/2MS培 养基上12天。三个独立的转基因株系被用来检测。本实验重复三次以上，代表性的结果被 用来展示。
[0029] 图14为生长在1/2MS与含有75 y M 0(1(：12的1/2MS培养基上12天的拟南芥幼苗 (5棵）的鲜重（个株系不少于20棵幼苗被用来测量，误差线表示三次独立重复实验的标准 偏差）。
[0030] 图15为Zm0XS2b与Zm02Ll蛋白结合(HMT1启动子中B0XS2附近的区域。用染色 体免疫共沉淀（ChIP)的技术来检测Zm0XS2b与Zm02Ll蛋白。根据CIMT1的启动子设计的 引物组与ACT2的启动子的引物被用作免疫共沉淀后的qPCR检测。黑色小方框表示预测的 B0XS2序列CTTCTTGTC ;大括号表示qPCR检测的片段。数据显示的是三个独立生物学实验 的平均值。误差线表示三次独立重复实验的标准偏差。
[0031] 图16为Zm0XS2b与Zm02Ll蛋白结合DEGs启动子中B0XS2附近的区域。用染色 体免疫共沉淀（ChIP)的技术来检测Zm0XS2b与Zm02Ll蛋白。根据8个选择的差异表达 基因的启动子设计的引物组与ACT2的启动子的引物被用作免疫共沉淀后的qPCR检测。将 每个样品（DNA与蛋白复合物）与a-Flag抗体或者没有抗体的对照（NoAb)共沉淀后所得 的CP值标准化到其样品的inpu