一种产鸡溶菌酶的基因工程菌及其构建与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种产鸡溶菌酶的基因工程菌，属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作天然 的食品防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以 添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道 中双歧杆菌的增殖。
[0003] 溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药 理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，医用溶菌酶其适应症为出血、血尿、血痰和鼻 炎等，溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理G+细菌得到原生质体，因此，溶 菌酶是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种产鸡溶菌酶的基因工程菌NCY-02,用于鸡溶菌酶的生 产。本发明的基因工程菌已于2015年5月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心，保藏地址为中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo. 10780,分类学 命名为毕赤酵母（Pichiapastoris)x_33-pPICZaA-lysozyme。
[0005] 本发明的技术方案如下：一株产鸡溶菌酶的酵母基因工程菌NCY-02,保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国科学院微生物研究所，保藏 日期为2015年5月5日，保藏号为CGMCCNo. 10780。
[0006] 本发明第二方面公开了前述产鸡溶菌酶酵母基因工程菌的构建方法，包括以下步 骤：
[0007] 1)合成SEQIDN0:1所示的鸡溶菌酶表达序列；
[0008] 2)将步骤1)所述鸡溶菌酶表达序列连接到毕赤酵母载体pPICZa上，得到重组质 粒pPICZaA-lysozyme;
[0009] 3)将步骤2)的重组质粒pPICZaA-lysozyme转化毕赤酵母x-33,得到产鸡溶菌 酶的基因工程菌毕赤酵母x-33-pPICZaA-lysozyme。
[0010] 进一步，步骤2)中，将鸡溶菌酶表达序列采用限制性内切酶xhoI和NotI进行 双酶切，连接到同样用xhoI和NotI双酶切回收后的毕赤酵母载体pPICZa上，获得重组 质粒pPICZaA-lysozyme〇
[0011] 本发明第三方面公开了前述产鸡溶菌酶酵母基因工程菌在鸡溶菌酶生产中的应 用。
[0012] 进一步，产鸡溶菌酶酵母基因工程菌的种子培养基采用YH)培养基；基本发酵培 养基采用BMGY培养基；诱导培养基为BMMY培养基。
[0013] 本发明的有益效果是：本发明的产鸡溶菌酶酵母基因工程菌表达的鸡溶菌酶在 摇瓶培养后的酶活可以达到5000-7000u/ml左右，10L机械搅拌生物反应器水平上发酵酶 活可以达到20000u/ml以上。该构建菌株发酵生产鸡溶菌酶取代目前从蛋清中提取的生 产方法，具有生产周期短、分离纯化成本低等一系列优点，而且发酵生产过程中产生的废 弃物一一酵母细胞有着广泛的应用价值，这为该菌株大规模生产鸡溶菌酶奠定了良好的基 础。
【附图说明】
[0014]图 1:pPICZaA质粒图谱；
[0015] 图2:重组质粒的酶切图谱（其中，M为DL5000DNAmarker，编号1是线性化质粒 pPICZa，编号2-7为双酶切的重组质粒pPICZaA-lysozyme);
[0016] 图3:质粒酶切结果（其中，M为DL5000DNAmarker,编号1是线性化质粒 pPICZa，编号 2-5 为Bglll线性化重组质粒pPICZa-lysozyme);
[0017] 图4:重组毕赤酵母诱导表达后考马斯亮蓝染色电泳图（其中，Ml和M2为蛋白标 准品，编号1-8为诱导表达后的重组蛋白）。
【具体实施方式】
[0018] 以下结合附图1-4对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发 明，并非用于限定本发明的范围。
[0019]实施例1重组菌的构建及鉴定
[0020] 通过NCBI收录的鸡溶菌酶基因GenBank:J00882. 1，设计出鸡溶菌酶表达序列（两 端插入了xhol和xbal酶切位点），如SEQIDN0 :1所示，并交由上海生工生物工程股份有 限公司合成，连接于puc57载体，获得puc57_lysozyme。
[0021]用限制性内切酶xhoI和NotI分别双酶切puc57-lysozyme和酵母载体pPICZa， 并回收。用T4DNA连接酶于4°C过夜连接，连接产物转化进入感受态大肠杆菌，37°C摇菌1 小时，涂布在含有博来霉素（ze〇cin，0. 25ug/ul)的LB平板上，37°C过夜培养，挑选菌落并 提质粒，最终获得含有鸡溶菌酶基因的重组表达质粒pPICZaA-lysozyme，用双酶切进行验 证，验证结果如图2所示。
[0022] 将验证正确的重组质粒pPICZaA-lysozyme电击转化毕赤酵母x-33(Pichia pastorisx-33)感受态细胞，得到基因工程菌，并经过鉴定命名为毕赤酵母（Pichia pastoris)x-33-pPICZaA-lysozyme〇
[0023] 毕赤酵母的转化采用电转化法为：将毕赤酵母x-33于50mLYPD中培养至0D600 =1. 2,1500g离心收集细胞；依次用50mL，25ml冰冷的无菌水洗两次细胞，再用10mL冰冷 的lmol/L山梨醇洗一次细胞，重悬细胞于100ullmol/L山梨醇液中，获得感受态细胞。取 80yL酵母感受态细胞，与5-10yg线性化重组质粒DNA(BglII酶切）混合，转入冰冷的电 转杯，放置5分钟；电击感受态细胞与线性化DNA的混合物（2kv，15ms);加入lmL冰冷的 lmol/L山梨醇，吸入15ml离心管中，在30°C静止放置lh;然后涂布于固体YPDS培养基，在 30°C培养4~6天后挑取单克隆，获得产鸡溶菌酶的基因工程菌株，用Bglll酶切进行验 证，验证结果如图3所示。
[0024] 实施例2重组菌的诱导表达和蛋白电泳
[0025] 1.培养基的配制
[0026] YPD培养基（1L):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g;
[0027]YPDS固体培养基（1L):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g，182. 2g山梨 醇，20g琼脂粉；
[0028]BMGY培养基（1L):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB13. 4g，lOOmM磷 酸缓冲液（pH6. 0)，40mg生物素；
[0029] BMMY培养基（1L):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇5mL，YNB13. 4g，lOOmM磷 酸缓冲液（pH6. 0)，40mg生物素。
[0030] 2.鸡溶菌酶诱导表达方法
[0031] 以实施例1获得的产鸡溶菌酶酵母基因工程菌为生产菌株，活化后，将30°C， 220rpm下培养过夜的种子（YH)培养基）以10%的接种量转入基本发酵培养基（BMGY培养 基），于30°C、220rpm条件下培养至0D值为1. 2~1. 5时，将酵母细胞转入BMMY培养基中 诱导蛋白的产生。
[0032] 通过蛋白电泳（SDS-PAGE)得到一条分子量大小在lOkDa和15kDa之间的蛋白 条带，如图4所示（蛋白标准品商品名PageRulerPrest，厂商ThemScientific，范围 10-110KD)，能看到在15kD之下有一条染色最深的条带，为目的条带。
[0033] 3.酶活
[0034] 参考GB/T25879-2010方法检测发酵液中的酶活力，检测结果显示，本实施例摇瓶 培养获得的鸡溶菌酶酶活可以达到5000-7000u/ml。
[0035] 实施例3重组蛋白的发酵培养
[0036] 以实施例1获得的溶菌酶产生菌CNY-02为生产菌株，接种于YH)培养基中，在 30°C、220rpm下培养18小时后作为种子液，按照10v/v%的接种量转入容积为10L的机械 搅拌式生物反应器内，发酵培养基采用无机盐培养基。发酵温度30°C，搅拌转速：350r/m， 通风比：0. 2VVM，起始pH值为5. 0。
[0037] 发酵培养基成分如下：
[0038]
[0039]将配置好的发酵培养基灭菌冷却到30°C，氨水调节pH值为5. 0后接种种子液。
[0040] 发酵24小时后添加甲醇，浓度为10ml/L开始诱导溶菌酶蛋白。以后每24小时添 加一次甲醇，甲醇浓度仍为l〇ml/L。诱导96小时后发酵过程结束。
[0041]
[0042] 经GB/T25879-2010方法检测鸡溶菌酶酶活，发酵液中溶菌酶的酶活力达到 18000-20000u/ml〇
[0043] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一株产鸡溶菌酶的酵母基因工程菌NCY-02,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，保藏地址为中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年5月5日，保 藏号为 CGMCC No. 10780。2. 权利要求1所述产鸡溶菌酶酵母基因工程菌的构建方法，包括以下步骤： 1) 合成SEQ ID NO :1所示的鸡溶菌酶表达序列； 2) 将步骤1)所述鸡溶菌酶表达序列连接到毕赤酵母载体pPICZ a上，得到重组质粒 pPICZ a A-Iysozyme ； 3) 将步骤2)的重组质粒pPICZ a A-Iysozyme转化毕赤酵母x-33,得到产鸡溶菌酶的 基因工程菌毕赤酵母x-33-pPICZ a A - lysozyme。3. 如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤2)中，将鸡溶菌酶表达序列采用限 制性内切酶xho I和Not I进行双酶切，连接到同样用xho I和Not I双酶切回收后的毕 赤酵母载体pPICZ a上，获得重组质粒pPICZ a A-Iysozyme。4. 权利要求1所述产鸡溶菌酶酵母基因工程菌在鸡溶菌酶生产中的应用。5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，产鸡溶菌酶酵母基因工程菌的种子培养基 采用YH)培养基；基本发酵培养基采用BMGY培养基；诱导培养基为BMMY培养基。
【专利摘要】本发明公开了一种产鸡溶菌酶的基因工程菌及其建方法与应用，公开了一株产鸡溶菌酶的基因工程菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年5月5日，保藏号为CGMCC？No.10780。本发明采用重组DNA技术将鸡(Gallus？gallus)的溶菌酶(lysozyme)cDNA克隆连接到毕赤酵母表达载体pPICZαA，并转化毕赤酵母X-33，经筛选鉴定得到一株产高活性鸡溶菌酶的重组毕赤酵母x-33pPICZαA-α-lysozyme。该菌株表达的鸡溶菌酶在摇瓶中的酶活为5000-7000u/ml，为鸡溶菌酶的大规模生产奠定了良好的基础。CGMCC No.1078020150505
【IPC分类】C12N9/36, C12R1/84, C12N15/81, C12N1/19
【公开号】CN105039189
【申请号】CN201510350298
【发明人】王向东, 宗臣, 林剑, 单守水
【申请人】山东新概念生物技术有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月23日