一种微生物发酵生产氨基葡萄糖的菌株及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖 和D-氨基葡萄糖的菌株及其方法。
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【背景技术】
[0003] N-乙酰-D-氨基葡萄糖是单糖，是真菌(担子菌、霉菌或酵母）菌体细胞壁几丁 质，或甲壳类动物如蟹、虾类壳的组成成份，也可作为食品内含量极少的营养成份。N-乙 酰-D-氨基葡萄糖具有与氨基葡萄糖相似的效果，摄取一定量的N-乙酰-D-氨基葡萄糖可 以诱导新软骨的产生，并抑制骨关节炎的发作，而在一些病例中，N-乙酰-D-氨基葡萄糖也 可用来治疗骨关节炎。由于氨基葡萄糖有苦味，而N-乙酰-D-氨基葡萄糖有蔗糖50%的甜 味并且很容易摄取，因此，N-乙酰-D-氨基葡萄糖作为氨基葡萄糖的替代物质已经收到了 广泛的关注。
[0004] 传统的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的生产是以甲壳类动物壳作为原料。其生产方法 包括：压碎甲壳类动物的壳；采用稀释酸溶液对压碎的壳脱钙；利用碱去除蛋白质得到纯 化的甲壳素；利用酸水解得到的甲壳素以生产氨基葡萄糖；然后对氨基葡萄糖进行无水醋 酸乙酰化，从而得到N-乙酰-D-氨基葡萄糖。利用酸水解甲壳素生产氨基葡萄糖的方法， 还包括以真菌渣(如柠檬酸发酵使用的黑曲霉菌的菌渣）为原料，在高浓度盐酸作用下水解 生产氨基葡萄糖，参见2006年5月23日公告的美国专利US7049433B2,其公开了氨基葡萄 糖及从微生物量中制备氨基葡萄糖的方法。
[0005] 此外，传统方法还包括：（1)利用微生物产生的酶降解来自虾壳原料产生的甲壳 素以生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖，参见1999年12月7日公告的美国专利US5998173,其 公开了N-乙酰-D-氨基葡萄糖的制备过程；（2)利用微生物(木霉菌)产生的酶进行酶解或 用酸部分水解纯化来自真菌渣(柠檬酸发酵使用的黑曲霉菌的菌渣）的甲壳素以生产N-乙 酰-D-氨基葡萄糖，参见2003年4月17日公告的美国专利US20030073666A1，其公开了 N-乙酰-D-氨基葡萄糖及其制备方法；（3)通过培养绿藻病毒（C^oroKiri/61)感染的小球 藻细胞或者导入了源自绿藻病毒基因的重组大肠杆菌来生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖，参 见2004年10月14日公告的日本专利JP2004283144A，其公开了制备氨基葡萄糖和N-乙 酰-D-氨基葡萄糖的方法；（4)采用遗传修饰的微生物，特别是遗传修饰的大肠杆菌，发酵 生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖，参见2004年1月8日公告的W02004/003175,其公开了氨基 葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖的生产工艺及材料；（5)用木霉菌直接使用葡萄糖为碳源，不 需要来自真菌渣或虾壳产生的甲壳素和壳多糖寡糖的碳源，发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄 糖，参见2011年3月10日公告的美国专利US20110059489A1，其公开了利用微生物发酵生 产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法。
[0006] 上述采用甲壳类动物壳或曲霉菌渣(柠檬酸渣）为原料通过化学水解生产N-乙 酰-D-氨基葡萄糖或D-氨基葡萄糖的方法，通常需要使用高浓度的酸溶液和碱溶液，因此 会产生大量废液。而利用虾蟹壳为原料提取D-氨基葡萄糖，每生产1吨D-氨基葡萄糖就 可能产生100吨以上废水和大量废渣。而通过柠檬酸渣提取，每30-50吨柠檬酸渣仅能产1 吨D-氨基葡萄糖。并且，使用微生物或微生物产生的酶来降解源自甲壳类动物如蟹、虾类 壳的甲壳素以生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法存在产量低和成本高的问题。
[0007] 而通过培养绿藻病毒感染的小球藻细胞生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖，需要通过压 碎细胞获取N-乙酰-D-氨基葡萄糖，存在操作复杂的问题。利用遗传修饰的微生物生产 N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法则需要采取适当措施来避免微生物在设备内的扩散，同样存 在操作复杂的问题，甚至关乎食品安全及威胁社会的问题。
[0008] 此外，用木霉菌直接使用葡萄糖为碳源发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法， 虽然具有不需要使用来自甲壳类动物壳或真菌渣产生的甲壳素或壳多糖寡糖等碳源的优 点，但是由于木霉菌等真菌发酵温度低、时间长、产量偏低，从而导致其存在生产周期长、成 本高、易污染等缺点，并严重限制了该方法的工业化应用。
[0009] 因此，针对传统的N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖生产方法存在的上述 缺点，亟需寻找一种新的，同时具有工业化应用前景的N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡 萄糖的生产方法。
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【发明内容】
[0011] 本发明的目的是提供一种微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄 糖的方法，以克服目前现有技术存在的上述不足。
[0012] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现： 根据本发明的一方面，提供了一种微生物发酵N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄 糖的非遗传重组菌株，其特征在于，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，一种枯草芽孢杆菌BacillussubtilisNJ090259菌株，保藏号为CGMCC10257,保藏日 期为2014年12月29日，以及一种地衣芽抱杆菌BacilluslincheniformisNJ091195菌 株，保藏号为CGMCC10258,保藏日期为2014年12月29日，保藏单位地址为北京市朝阳区北 辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0013] 根据本发明的另一方面，利用上述菌株发酵生产非动物源性N-乙酰-D-氨基葡 萄糖和D-氨基葡萄糖的方法，以该菌为出发菌种，经种子培养和已优化的培养基发酵产生 N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖，包括以下步骤： (1)菌株筛选、鉴定与培养 采集50份土壤样品，稀释后涂布于初筛平板，采用初筛培养基：胶体几丁质2. 5 g/L，磷酸氢二钾0.7 g/L，磷酸二氢钾0.3 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，琼脂20 g/ L，pH7. 0,培养温度37°C，培养时间72h，进行培养，得到单菌落，分离菌落，得到枯草芽孢 杆菌和地衣芽孢杆菌，并对其进行摇瓶发酵培养，测定发酵液几丁质酶活力，并根据发酵液 含几丁质酶活力筛选菌株； (2 )发酵培养 将在平板培养基上活化后的枯草芽孢杆菌（你ciWMNJ090259、地衣芽孢 杆菌NJ091195分别接入种子培养基中，恒温摇床培养，用作 种子液，接入发酵培养基中，恒温摇床培养，离心取上清液，测定N-乙酰-D-氨基葡萄糖含 量； 平板培养基：胶体几丁质30g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁0.5g/L， 氯化钠 〇? 5g/L，琼脂 20g/L，pH6. 5 ; 种子培养基：蛋白胨5. 0g/L，牛肉膏5. 0g/L，氯化钠5. 0g/L，pH7. 0-7. 2 ; 发酵培养基：胶体几丁质10g/L，葡萄糖10g/L，酵母膏3. 0g/L，MgS04*7H20 0. 6g/L，FeS04 ? 7H20 0? 01g/L，KH2P04 0? 4g/L，K2HP04 0? 6g/L，ZnS04 0? 001g/L; 发酵条件：温度35°C，发酵时间18h，起始pH6. 5,接种量10%，装液量50ml/250ml; (3) N-乙酰-D-氨基葡萄糖发酵液纯化 将由培养基离心获得的上清液，电渗析除盐，将除盐后发酵液真空加热，浓缩至过 饱和，对浓缩后的发酵液进行降温，并加入5倍无水乙醇，搅拌离心，得到高纯度N-乙 酰-D-氨基葡萄糖结晶； (4) N-乙酰-D-氨基葡萄糖酸化水解 将N-乙酰-D-氨基葡萄糖结晶粗品配制成饱和溶液，加入37%浓盐酸至终浓度为 12-16%，90°C保温45-90min，冷却过夜，过滤得到的晶体用乙醇洗涤、真空干燥并检测，得到 高纯度D-氨基葡萄糖盐酸盐，收率为86%。
[0014] 进一步的，所述培养基的碳源和氮源如下：所述碳源包括葡萄糖、黑曲霉菌渣、木 霉菌渣、黑木耳生产下脚料、香菇生产下脚料、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖浆和 糖蜜中的一种或几种，所述氮源包括氨水、豆粉、麦芽、玉米浆、棉籽粉、酵母浸膏、氯化铵、 硫酸铵、硝酸铵、醋酸铵、硝酸钠和尿素中的一种或几种。
[0015] 进一步的，所述真菌为担子菌、霉菌和酵母菌种的一种或几种。
[0016] 本发明从不同环境条件下的土壤中筛选出枯草芽孢杆菌（你ciWM NJ090259 和地衣芽孢杆菌（你NJ091195,所述NJ090259 菌株和 NJ091195的细菌学特性如下： 1、NJ090259菌株的细菌学特性 (1) 培养学/形态学特性 NJ090259菌株生长时是脓状浅黄色半透明菌落，菌落表面光滑；菌落圆形，直 径4-7mm;低凸起，规则，放射状，边缘叶状；表面皱褶，无光泽，灰白色，带有鳞片，不透 明；生长到一定程度后就变成奶白色菌落，伞形，菌落表面有褶皱，菌落较大，中央突起； 单菌杆状，两端钝圆，单个排列，偶尔2-3个细菌排成短链，经涂片干燥的染色的细菌 0.7-0. 8X2-3ym，革兰氏阳性，液体发酵24h后有芽孢出现，芽孢中生或端生，椭圆形，不 明显膨胀；在液体基质中呈均匀混浊，不形成菌膜和菌环； (2) 生理生化特性 NJ090259菌株专性好氧，不具凝乳作用，过氧化氢酶实验、硝酸盐还原实验、V-P实验 阳性；苯丙氨酸脱氨酶实验、卵黄卵磷脂酶实验阴性；分解葡萄糖产酸不产气，能分解阿拉 伯糖、甘露醇、酪素、明胶、淀粉。
[0017] 2、NJ091195菌株的细菌学特性 (1)培养学/形态学特性 NJ091195菌株当培养于肉汤琼脂平板上时，菌落近似圆形，乳白色，表面暗，不透明，边 缘不整齐，粗糙；菌落与培养基紧贴，不易挑取；液体培养有菌膜，无浑浊，无沉淀；单菌呈 短棒状，两端钝圆，单个或2个并排排列，菌体长度1. 5-3. 0ym，菌体宽度0? 6-1. 0ym，革兰 阳性，芽孢呈椭圆形，中间膨大，芽孢在中间或偏一端； (2)生理学特性 NJ091195菌株接触酶试验呈阳性，可在含7%NaCl的培养基上生长，可在50°C条件下生 长，具有运动性，可利用柠檬酸盐，可水解淀粉，甲基红试验呈阴性，革兰氏染色阳性，卵磷 脂酶试验阴性，V.P试验阳性，可利用硝酸盐，pH5. 7的营养肉汤下可生长，可发酵几丁质、 D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖和D-甘露醇产酸，可使明胶液化。
[0018] 本发明的有益效果为：提供了一种生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨