一种鸭疫里氏杆菌基因缺失株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物细菌基因工程技术领域，涉及动物分子生物学、免疫学等相关领 域。具体涉及一种鸭疫里氏杆菌双组份调控系统06537/06542基因缺失菌株及应用。
【背景技术】
[0002] 鸭疫里氏杆菌感染是由鸭疫里氏杆菌（Riemerellaanatipestifer，RA)引起雏鸭 的一种急性、接触性、败血性传染病，由于该病的高发生率、高死亡率和预后的生长迟缓，在 我国肉鸭规模化养殖过程中已成为一个较为严重的问题。目前国外已报道有21个血清型， 在国内还发现了 4个新的血清型。目从我省分离鉴定的RA菌株中只发现了血清1型。目前 对于鸭疫里氏杆菌的毒力相关基因还知之甚少，已经确定的毒力因子有外膜蛋白A(0mpA) 和二肽肽酶IV(DPPIV)。除此之外还有一些推测与毒力相关的因子。对RA的研究虽然取 得了一些进展，但其分子致病机理仍然不清楚。因此，加强RA分子生物学和致病机制的研 究，对从根本上防止该病的发生具有重要的现实意义。
[0003] 药物治疗是治疗和预防家禽感染鸭疫里氏杆菌的主要方法，当前一般使用抗生素 和磺胺类药物来预防和治疗这种疾病，但是抗生素的广泛使用容易导致耐药菌株的出现。 由于RA的血清型复杂，不同地区的菌株对不同的药物的使用效果也不同。因此在使用抗生 素前应对菌株进行相关药敏测试，通过比较确定最佳用药方案。而疫苗免疫方面，由于RA 的血清型较多，且不同血清型之间基本上没有或只有非常低的交叉免疫保护力，因此世界 各国学者都致力于鸭疫里氏杆菌基因工程疫苗的研究，力求获得一种更加安全、高效的新 型疫苗。
[0004]细菌基因工程疫苗是现代疫苗的发展方向之一。使用安全性高、毒力弱的基因工 程活疫苗作为疫苗有很多优点：首先它可通过滴鼻或喷雾等方式接种，能激发机体产生有 效的黏膜免疫，同时也能激发机体的系统免疫；其次，它通过滴鼻或喷雾等方式接种，操作 简便易行；三是其免疫原性好，能产生很好的保护力；四是基因工程活疫苗可对不同血清 型的鸭疫里氏杆菌产生保护力；五是生产方面，快速经济，适合在基层大面积推广；六是它 可携带较大的外源基因片段，易于构建多价基因工程疫苗，达到一种疫苗预防多种疾病的 目的。随着对鸭疫里氏杆菌的分子生物学及分子致病机理的深入研究，利用现代分子生物 学技术手段与基因工程方法，通过对与代谢相关的因子的失活，构建低毒力的菌株，研制成 鸭疫里氏杆菌基因工程弱毒活疫苗，对预防和控制鸭疫里氏杆菌病具有十分重要的意义。 [0005]目前国内外已有学者开始对鸭疫里氏杆菌作为弱毒活疫苗进行研究，但迄今为止 还没有一个较为成熟的产品问世。本发明前期通过体内诱导抗原技术和生物信息学分析找 到了一对RA云梦株（RA-YM)在感染鸭体内诱导表达的新基因，即06537/06542,推测该基 因可能与毒力有关。因此，我们首先克隆06537/06542基因及其上下游同源臂基因，构建重 组自杀性质粒，利用壮观霉素抗性和PCR进行06537/06542基因缺失株的筛选，并对其遗传 稳定性、毒力及对雏鸭的致病性和免疫原性进行了研究。利用自行构建的基因工程菌株，研 制具有我国知识产权的基因工程载体并应用于生产，将是我国应对当今畜牧业所面临的挑 战，提高竞争力的有力措施。
[0006] 参考文献
[0007] 1.陈芬芬.鸭疫里氏杆菌体内诱导抗原基因的筛选与应用研究.中国知网.湖北 武汉：华中农业大学，2008
[0008] 2.李继祥.鸭疫里默氏杆菌致病相关因子研究.[博士学位论文].重庆：西南大 学，2009
[0009] 3.谢妙妙.鸭疫里氏杆菌ECFssigma基因缺失突变株的构建及其生物学特性研 究.[硕士学位论文].湖北武汉：华中农业大学，2014
[0010] 4.熊涛.湖北省鸭疫里默氏杆菌病的研究.[硕士学位论文].湖北武汉：华中农 业大学，2001
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于提供一株鸭疫里氏杆菌基因缺失菌株。该菌株由于缺失了双组 份调控系统06537/06542基因的一部分片段，导致毒力下降。本发明还提供所述菌株在制 备鸭疫里氏杆菌弱毒疫苗中的应用。
[0012] 本发明的总体技术路线图见图1所示，鸭疫里氏杆菌基因缺失株构建路线如图2 所示。
[0013] 本发明是这样实现的：
[0014] 为了实现本发明，申请人首先查阅了RA-YM株全基因组序列的注释。结果表明， 其存在3个经典TCS。本实验选取陈芬芬（2008)通过体内诱导抗原技术筛选到的双组分 调控系统Ive-3,即06537/06542作为研究对象。其编码基因在RA-YM基因组上的位置为 52760bp-53989bp。其中，组氨酸激酶HK的编码基因Ive-3a位于RAYM_06537上，由524个 核苷酸组成，共编码174氨基酸。反应调控因子RR的编码基因Ive-3b位于RAYM_06542上， 由688个核苷酸组成，共编码228个氨基酸。从图3中可看出，两个编码基因在基因组上的 位置比邻，转录方向一致，且中间只间隔了 18bp，这与一般的双组分调控系统的结构特征相 符。
[0015] 以文献报导的RA-YM株基因组为模板，以LeftarmL1和LeftarmL2、RightarmR1 和RightarmR2为引物，提取的RA-YM株基因组为模板进行PCR扩增，扩增条带经电泳图显 示，大小约为500bp左右，与预期的目的片段454bp和456bp-致，将扩增产物回收。由于 RA-YM对壮观霉素敏感，因此用引物SpcRSl、SpcRS2从pIC333质粒上扩增壮观霉素抗性 基因以作为筛选标记，扩增产物经电泳图显示，条带约为l〇〇〇bp左右，大小与预期目的片 段llOObp-致，将扩增产物回收。将回收的Leftarm、Rightarm和3口〇[!片段通过Overlap PCR连接，将扩增产物回收，与pMD18-T载体连接，连接产物转化的阳性克隆进行SpcR抗性 基因PCR鉴定和双酶切鉴定。将酶切鉴定的阳性克隆送往北京擎科测序，BLASTn比对同源 性99%。分别用邱111和5&(3 1将自杀性质粒口1?112和已构建含有目的片段的口1'-1^1? 质粒双酶切。目的片段回收，16°C水浴锅过夜连接，连接产物转化E.coliX7213。扩大培 养阳性克隆，提取质粒，用KpnI和SacI双酶切鉴定。双酶切电泳图显示有两条带，一条 带大小约为2000bp，另一条带大小约为5000bp，与预期的2010bp目的片段和pRE112质粒 相符。同时，SpcR基因PCR鉴定也表明重组自杀性质粒pRE112-LSR已成功构建。将转化 了重组自杀性质粒pRE-LSR的E.coliX7213菌株与RA-YM株进行接合转移，同源臂之间发 生交换，重组自杀性质粒pRE-LSR整合到RA-YM株的染色体上，发生结合转移的阳性接合子 表型为SpcR，能够在含Spc(50yg/mL)的TSA平板上生长，挑取抗性平板上的单菌落到含有 Spc(50yg/mL)的TSB培养基中过夜培养。以C-SpcR-CSl、C-SpcR-CS2为引物，扩增壮观霉 素抗性基因，得到ll00bp左右的SpcRS因片段，扩增结果显示SpcR片段成功插入基因组 中。设计两对引物Deta-Dl、Deta-D2和Check-Cl、Check-C2,分别扩增计划缺失的片段和 全长，阳性接合子过夜培养菌液为模板进行PCR扩增反应，前者无法扩增，后者得到1968bp 左右的片段。以RA-YM株作对照，PCR扩增反应得到330bp和1708bp左右的片段。PCR产 物电泳图显示已经成功缺失了06537/06542基因中的798bp的片段。将筛选到的RA-YM 06537/06542基因缺失株在含有Spc的TSB培养基中盲传，用引物C-SpcR-CSl、C-SpcR-CS2 和Deta-Dl、Deta-D2对每一代都进行鉴定。鉴定结果显示连续传了5代都没有扩增出已缺 失的06537/06542基因片段。
[0016] 本发明的原理是基因的同源重组，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源序列发 生重组，从而改变其遗传特性。我们通常使用电击转化，结合转移来实现同源重组。电击 转化法是将菌体制作成感受态的状态，利用高压电脉冲菌体细胞膜出现微孔，外源DNA片 段通过微孔进入菌体细胞核，与基因组发生重组，质膜随后修复，细菌恢复生长。电击转化 法依细胞的类型不同，可以选择和优化电击转化过程中的电场强度和DNA浓度等一系列参 数，得到比较高的DNA转化率。结合转移是在质粒转移的过程中，供体菌和受体菌通过结合 作用紧密接触，质粒从供体菌向受体菌转移，同时进行质粒复制。转移质粒带有tra基因， 能完整的编码转移酶，质粒能从一个细胞到另一个细胞自主地转移，如果质粒不含tra基 因，转移质粒中应该含有质粒转移起始位点oriT，虽然不能够自主转移，但是能被其他一些 含有完整的tra基因的质粒诱导转移。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：
[0018] 1.本发明所用的材料为鸭疫里氏杆菌野生致病菌株RA-YM，该菌株是从湖北云梦 某养鸭场分离所得一种血清1型菌株，血清1型为我国目前流行较广的血清型，因此以该致 病菌进一步构建的06537/06542基因缺失菌株RA-YMA06537/06542针对湖北地区乃至全 国均有广阔的应用前景。
[0019] 2.本发明发