一种蜡状芽孢杆菌、制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病虫害的生物防治技术领域，具体涉及一种蜡状芽孢杆菌，同时 还涉及一种蜡状芽孢杆菌的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 棉铃虫（Helicoverpaarmigera)属鳞翅目夜蛾科昆虫的一种，是经济作物的主要 害虫之一，主要危害棉花、玉米、番茄、辣椒等，给农业生产造成一定的威胁。棉铃虫是棉花 蕾铃期重要钻蛀性害虫，主要蛀食蕾、花、铃，也取食嫩叶。该虫是中国棉区蕾铃期害虫的优 势种，近年为害十分猖獗。
[0003] 棉铃虫成虫白天隐藏在叶背等处，黄昏开始活动，取食花蜜，有趋光性，卵散产于 棉株上部。幼虫5~6龄。初龄幼虫取食嫩叶，其后为害蕾、花、铃，多从基部蛀入蕾、铃，在 内取食，并能转移为害。受害幼蕾苞叶张开、脱落，被蛀青铃易受污染而腐烂。老熟幼虫吐 丝下垂，多数入土作土室化蛹，以蛹越冬。棉铃虫天敌很多，已知有赤眼蜂、姬蜂、寄蝇等寄 生性天敌和草蛉、黄蜂、猎蝽等捕食性天敌，及一些细菌、真菌、病毒等可对棉铃虫的卵和幼 虫起到抑制作用。
[0004] 20世纪90年代以后，棉铃虫发生有逐年加重的趋势（史应武，赵思峰，等.新疆 棉铃虫病原微生物分离及其高效杀虫微生物的筛选[J].石河子大学学报（自然科学版）， 2003, 7 (2) : 115-118)，尤其是新疆棉区，棉铃虫每隔3-5年暴发1次（黄顶成，田长彦，张润 志.地膜覆盖对棉铃虫羽化的影响初探[J].干旱区研究，2010, 27(5) :801-805)。单纯的 使用化学药剂已经不能有效地防治棉铃虫，并且化学药剂的使用即提高了防治成本，又造 成了环境污染（万鲁长，曹德强，等.棉铃虫致病菌BT-931菌株的应用研究[J].微生物学 杂志，1995,（2) :8-14)。从微生物中筛选高效低毒的生物农药不仅可以保护环境，而且还能 减少农药残留，是一条防治棉铃虫的有效途径。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种可防治植物棉铃虫虫害的蜡状芽孢杆菌。
[0006] 本发明的第二个目的是提供一种蜡状芽孢杆菌的制备方法。
[0007] 本发明的第三个目的是提供一种蜡状芽孢杆菌在防治植物棉铃虫虫害方面的应 用。
[0008] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0009] -种錯状芽孢杆菌，该菌株为錯状芽孢杆菌（Bacilluscereus)ML19,于2014年 9月24日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏编号 为CCTCCNO:M2014445。
[0010] -种上述的蜡状芽孢杆菌的制备方法，包括下列步骤：
[0011] 1)对采集自大田的死亡棉铃虫进行分离，得到蜡状芽孢杆菌菌株；
[0012] 2)以初孵棉铃虫和二龄幼虫为试虫，进行生物活性测试，通过比较初孵棉铃虫死 亡率和以二龄幼虫为试虫时棉铃虫的化蛹率、羽化率，筛选得到所述的蜡状芽孢杆菌ML19。
[0013] 步骤1)中，从死亡棉铃虫中分离蜡状芽孢杆菌菌株的方法包括：
[0014]a.采集大田中死亡的棉铃虫，在乙醇溶液中浸泡，然后用氯化汞溶液消毒，再用无 菌水冲洗后，于灭菌的研钵中研磨，加入无菌水得研磨液原液；
[0015]b.将步骤a所得研磨液原液的稀释液，涂布于NA培养基平板上，在28°C下培养， 分离纯化，备用。
[0016] 所述分离纯化是，在28°C培养时观察到单菌菌落特征为：菌落不透明，表面粗糙， 似蜡状，边缘粉红色，不整齐；将具有上述特征的单菌菌落重新划线培养于NA培养基平板 上，得到的单菌落形态特征一致，重复划线纯化三次，将最后一次纯化的单菌落划线培养于 NA斜面培养基，备用。
[0017] 步骤a中，所述乙醇溶液中乙醇的体积分数为75% ;所述氯化汞溶液中氯化汞的 质量分数为1%。
[0018] 步骤a中，在乙醇溶液中浸泡时间为30s;用氯化萊溶液消毒时间为3min。步骤a 中，在制备研磨液原液时，加入无菌水的量为：每1头棉铃虫加入2~3ml无菌水。
[0019] 步骤b中，所述研磨液原液的稀释液的稀释倍数为10~100。
[0020] 步骤b中，所述NA培养基的配方为：牛肉浸膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂18g， 加蒸馏水至1000ml。
[0021] 步骤2)中，所述生物活性测试的方法包括：
[0022] i)将步骤1)所得蜡状芽孢杆菌菌株活化培养，离心后用灭菌水悬浮得悬浮液；
[0023] ii)将步骤i)所得悬浮液与饲喂棉铃虫的人工饲料混合均匀，得混合饲料；
[0024] iii)将初孵棉铃虫接于步骤ii)所得混合饲料上，饲养6h后，统计死、活虫数量， 计算死亡率：
[0025] 死亡率（％ )=死亡虫数/供试虫数X 100;
[0026] 将二龄幼虫接于步骤ii)所得混合饲料上，饲养至羽化，统计化蛹数和羽化数，计 算化蛹率和羽化率：
[0027] 化蛹率（％ )=化蛹虫数/供试虫数X100 ;
[0028] 羽化率（％ )=羽化虫数/化蛹虫数X 100。
[0029] 步骤i)中，所述活化培养采用NB培养基，配方为：牛肉浸膏5g，蛋白胨10g，氯化 钠5g，加蒸馏水至1000ml。步骤i)所得悬浮液中菌株的浓度为500yg/ml。
[0030] 步骤ii)中，所述人工饲料的配方为：每500ml人工饲料含有琼脂8g、麦麸70g、干 酵母10g、玉米油3ml、山梨酸lg、抗坏血酸1. 5g。其中所述麦麸为无菌麦麸。人工饲料的 制备方法为：将琼脂加水煮沸使琼脂融化，在温度低于90°C后依次加入无菌麦麸、干酵母、 玉米油、山梨醇、抗坏血酸，搅拌均匀，定容即得。
[0031 ] 步骤ii)中，悬浮液与人工饲料的体积比为1:25。
[0032] -种上述的蜡状芽孢杆菌在防治植物棉铃虫虫害方面的应用。
[0033] 本发明的蜡状芽孢杆菌，是从大田中死亡的棉铃虫分离筛选出的对棉铃虫具有防 治效果的一株细菌菌株ML19,该菌株对初孵棉铃虫幼虫具有很高的杀虫活性，并能有效阻 止棉铃虫幼虫化蛹及羽化，使幼虫发育历期延长，发育缓慢，不能生长为成虫，从而对防治 植物棉铃虫虫害具有显著的效果，为防治植物棉铃虫虫害提供一条新的途径。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的说明。
【具体实施方式】 [0035] 中，细菌平板培养用NA培养基，配方为：牛肉浸膏5g，蛋白胨10g，氯 化钠5g，琼脂18g，加蒸馏水至1000ml;液体培养用NB培养基，配方为：牛肉浸膏5g，蛋白胨 l〇g，氯化钠5g，加蒸馏水至1000ml。
[0036] 实施例1
[0037] 本实施例的蜡状芽孢杆菌的制备方法，包括下列步骤：
[0038] 1)菌株分离：对采集自大田的死亡棉铃虫进行分离，得到蜡状芽孢杆菌菌株，具 体为：
[0039] a.采集大田中死亡的棉铃虫2头，在体积分数为75%的乙醇溶液中浸泡30s，然后 用质量分数为1 %的氯化汞溶液消毒3min，再用无菌水冲洗5次后，于灭菌的研钵中研磨， 加入5ml无菌水混合均勾，得研磨液原液；
[0040]b.取步骤a所得研磨液原液的100倍稀释液200y1，涂布于NA培养基平板上，在 28°C下培养，分离纯化，经16SrDNA序列同源性测定后，