一种基因工程菌及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种基因工程菌及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 卡那霉素（kanamycin)是由卡那链霉菌（Streptomyces.kanamyceticus CGMCX4. 1441)产生的一种氨基糖苷类抗生素，于1957年被Umezawa等人发现。从化学结构 上看，卡那霉素是2-D0S以糖苷键与卡那糖胺和D-葡萄糖胺连接形成的三糖化合物，包括 卡那霉素A、B和C三个组分，其中卡那霉素A是主组分，卡那霉素含量B在5%~7%之间。
[0003] 卡那霉素B是合成地贝卡星和阿贝卡星的原料。地贝卡星（dibekacin，DKB)保持 了卡那霉素B的抗菌活性，在抵制钝化酶APH(3'）的攻击方面明显强于卡那霉素B。阿贝 卡星（arbekacin)，它的耐酶性更好，而且耳、肾毒性较低，对许多耐甲氧西林的金黄色葡萄 球菌（MRSA)有效。
[0004] 多年来，对卡那链霉菌的研究一直停留在诱变育种和生产工艺的改进中。对卡那 霉素合成基因的研究也一直以体外表达为主。卡那霉素各组分间结构差异较小，物理性质 相近，造成下游分离困难，提高了生产成本。卡那霉素合成基因路径的阐述也为建立生产单 组分产物的工程菌奠定了基础。卡那霉素的生物合成基因簇于2004年在卡那链霉菌中首 次被分离。Kharel等从卡那链霉菌中克隆一段包含有40个0RF的序列，包含卡那霉素合成 基因、调苄基因、抗性基因和转运基因。
[0005] 分子生物学技术的发展使得利用基因工程手段改造抗生素组分成为可能。Hilda 等人于2011年在大肠杆菌中表达了KanJ和KanK，并深入探讨了酶的功能和抑制剂。KanJ 是Fe11 /a-酮戊二酸依赖的双脱氧酶，KanK是NADP依赖的酮还原酶，它们共同参与了卡那 霉素B转变为卡那霉素A的C2'位的脱氢和氨化作用。
[0006] 卡那霉素B的生产主要是从卡那霉素的发酵母液中分离提取，产量低而且工艺繁 琐，成本高，分离周期长，污染严重，产量不稳定。
[0007] 构建一株直接高产卡那霉素B的工程菌株，可以革命性地降低卡那霉素B的生产 成本，简化生产工艺，提高生产效率。卡那霉素B的工程菌株兼顾了节能减排和安全高效， 必然产生巨大的经济、社会和环境效益。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种直接产生卡那霉素B的工程菌及其构建方法和应用。卡 那链霉菌原始菌株中卡那霉素A的产量为93%，而卡那霉素B的量为7%。本发明利用基 因阻断技术对卡那链霉菌中的双脱氧酶基因（KanJ基因）进行破坏，以阻断卡那霉素A的 合成，使其主要产生卡那霉素B。
[0009] 本发明采用以下技术方案实现：
[0010] -方面，本发明提供经基因工程构建的卡那链霉菌（Streptomyces kanamyceticusXN126)，所述卡那链霉菌的双脱氧酶基因kanj失活或由kanj编码的双脱 氧酶失活。
[0011] 优选地，所述kanj基因选自下述序列中的至少一种：
[0012] (1)具有SEQIDNO: 1所示核苷酸序列的序列；
[0013] ⑵与⑴中的序列同源的序列；
[0014] (3)在严格条件下与（1)或（2)的序列杂交且编码双脱氧酶的序列；和/或
[0015] (4)核苷酸序列与（1)或（2)的序列有85%以上的同一性且编码双脱氧酶的序 列；
[0016] 优选地，所述kanj基因的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示。
[0017] 优选地，所述失活是通过选自基因敲除、基因置换、基因沉默、RNA干扰和点突变中 的一种或多种方式实现的。
[0018] 更优选地，所述卡那链霉菌为卡那霉素链霉菌（Streptomyceskanamyceticus)。 所述菌株已于2015年05月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏 编号：CGMCCNo. 10860。
[0019] 另一方面，本发明提供一种用于生产卡那霉素B及其衍生物的卡那链霉的方法， 所述方法包括：通过基因工程方法使卡那链霉菌中的kanj基因失活或由kanj基因编码的 双脱氧酶失活；
[0020] 优选地，所述失活是通过选自基因敲除、基因置换、基因沉默、RNA干扰和点突变中 的一种或多种方式实现的；
[0021] 优选地，所述方法为通过框架内缺失来阻断卡那链霉菌中的kanj基因。
[0022] 优选地，所述框架内缺失包括以下步骤：
[0023] (1)构建kanj基因双交换阻断质粒；
[0024] (2)使用步骤⑴中构建的质粒转化卡那链霉菌，获得转化子；
[0025] (3)筛选步骤⑵中获得的转化子，获得双交换菌株。
[0026] 优选地，步骤（1)包括构建含大肠杆菌中的复制起始位点ori、接合转移起始位点 oriT、大肠杆菌中的抗性筛选标记、链霉菌中的抗性筛选标记，kanj的上下游同源片段（核 苷酸序列为SEQIDN0:4)的kanj基因双交换阻断质粒；
[0027] 优选地，所述步骤（1)包括：
[0028] (1-1)以卡那链霉菌基因组DNA为模板，分别以SEQIDN0:5和SEQIDN0:6为上 游引物，SEQIDNO: 7和SEQIDNO: 8为下游引物，进行PCR扩增；
[0029] (1-2)连接步骤（1-1)中分别得到的扩增片段，得到kanj上游SEQIDN0:2所示的 核苷酸序列和kanj下游SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，然后上游序列用BamHI和EcoRI 酶切下游序列用EcoRI和Hindlll酶切，一起与经BamHI和Hindlll酶切的pIJ2925连接， 得到带有AkanJ(包括kanj上游SEQIDN0:2所示的核苷酸序列和kanj下游SEQIDN0:3 所示的核苷酸序列）片段的PIJ2925,命名为pDLJ201 ;
[0030] (1-3)以质粒pSET152为模版PCR扩增安普霉素（apramycin，Am)抗性基因和oriT 位点，将得到的扩增片段连接到用EcoRI和Kpnl酶切的质粒pIJ2925上，用T4DNA连接酶 连接环化；和
[0031] (1-4)用BamHI和Hindlll酶切步骤（1-3)中得至IJ的含Am抗性基因和oriT位点 的PIJ2925,然后与步骤（1-2)中得到的经BamHI和Hindlll酶切的pDLJ2925连接，获得kanj基因双交换阻断质粒pDLJ202。
[0032] 所述引物为：
[0033]JII1(SEQIDNO:5):
[0034] CGGGATCCAGGAGTCGCTATGAGCAAGAAG酶切位点：BamHI
[0035]JII2(SEQIDN0:6):
[0036] CGGAATTCATGGCTGGTCTTCCCTTCTCA酶切位点：EcoRI
[0037]JII3(SEQIDNO:7)：
[0038] CGGAATTCCCTGACGGGTGATCATCCCTT酶切位点：EcoRI
[0039]JIII4(SEQIDNO:8)：
[0040] CCAAGCTTGCGGAATGGGTCTGGTACATG酶切位点：Hindlll。
[0041] kanj基因双交换阻断质粒pDLJ202包括了kanj基因的上下游同源臂、筛选标记基 因Am抗性基因、oriT位点和几乎删去了kanj全部基因的AkanJ，是一种自杀型质粒；由于 所述质粒没有链霉菌复制起点，因此不能在链霉菌中复制。
[0042] 优选地，步骤（2)中所述的转化是以大肠杆菌（例如E.coliET12567)介导的接 合转移方法。
[0043] 优选地，所述步骤（2)包括：
[0044] (2-1)将步骤⑴得到的kanj基因双交换阻断质粒转化大肠杆菌，筛选氯霉素、卡 那霉素和安普霉素三抗性菌株，获得用于基因阻断的供体菌；和
[0045] (2-2)将步骤（2-1)得到的供体菌和经热激与预培养的卡那链霉菌单孢子悬液混 合培养，在安普霉素和萘啶酮酸存在下培养得到转化子。
[0046] 优选地，步骤（3)中所述的筛选是根据抗性表型筛选敏感菌落即在上下游同源片 段上各发生一次交换而使质粒脱落的双交换菌株或在同一同源片段上发生两次交换而使 质粒脱落的回复菌株，然后对抗性敏感菌株（双交换菌株或回复菌