兔血中超氧化物歧化酶的纯化制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物蛋白技术领域，具体涉及兔血中超氧化物歧化酶的纯化制备方法。
【背景技术】
[0002]兔血含有很高的营养价值，可加工成多种产品，供食用、药用，或作为畜禽的动物性饲料。兔血可提取多种生物药物和生化试剂，如医用血清、血清抗原、凝血酶、亮氨酸、蛋白胨，超氧化物歧化酶等，兔血医用价值高，但目前兔血提取技术仅限于实验室应用，无法达到纯化提取，且不能产业化提取和生产，对兔血的应用存在一定的局限性。
[0003]超氧化物歧化酶Orgotein (Superoxide Dismutase, S0D)，别名肝蛋白、简称:SOD0 SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,ECl.15.1.1, S0D)是1938年首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶，它在生物界的分布极广，几乎从动物到植物，甚至从人到单细胞生物，都有它的存在。SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。SOD是一种含有金属元素的活性蛋白酶。SOD是中国卫生部批准的具有药物功能的物质之一。
[0004]目前从动物血液中提取超氧化物歧化酶的工艺流程主要是血液抗凝一用生理盐水洗涤一低温溶血一氯仿乙醇抽提血红蛋白一磷酸钾萃取一热变性一丙酮沉淀一离子交换层析一分子筛柱层析。该工艺缺点是流程复杂，成本高昂，且氯仿、丙酮等有机溶剂具有较强的毒性，对环境具有严重污染，对操作人员身体亦造成不可估量的损害。
【发明内容】
[0005]为了克服现有技术存在的技术缺陷，本发明提供一种兔血中超氧化物歧化酶的纯化制备方法。
[0006]本发明解决其技术问题采用的技术方案是:兔血中超氧化物歧化酶的纯化制备方法，主要包括如下工艺步骤:
1、将50L新鲜兔血按16:1的比例加入4.0%的枸橼酸钠或柠檬酸钠，搅匀；
2、连续流离心机离心，离心力约为400g;离心上清为血浆，沉淀物为血球等细胞，收集沉淀；
3、将收集的沉淀用4倍生理盐水冲洗，连续流4000转离心，重复三次，去除血红蛋白；然后去离子水等倍体积搅拌溶血；
4、向溶血液中加入等倍体积95%的预冷乙醇，0.2倍体积的预冷氯仿；搅拌20分钟后静置I小时，然后4000转连续流离心，取上清，紫外分光光度计测定吸光度；
5、将上清加热到60°C，保温15分钟，然后迅速降温至室温，4000转连续流离心，收集上清，测定吸光度；然后生理盐水中冷却，加入预冷丙酮，搅拌，收集沉淀，然后用去离子水溶解；
6、上述沉淀用去离子水溶解后，采用G25脱盐柱层析；脱盐层析所得冷沉淀物的主要成分为超氧化物歧化酶；
7、离心:将冷沉淀的溶液在4°C的条件下，15，OOOg的离心力，离心约30min，沉淀、上清分开收集；
8、将沉淀用5mMHAC-NaAC溶液清洗2次后在用1mM pH为7.0的PBS溶液重溶，将重溶的超氧化物歧化酶通过0.45um的滤纸过滤；
9、将过滤后溶液经DE32离子交换层析；然后再经超滤；
10、将超滤后的SOD洗脱液在4°C的条件下，15000g的离心力，离心约30min，收集上清，即为SOD原液。
[0007]本发明提供的兔血中超氧化物歧化酶的纯化制备方法，操作简单，提取的超氧化物歧化酶纯度高。
【具体实施方式】
[0008]下面通过实施例来详细说明本发明的技术方案。
[0009]兔血中超氧化物歧化酶的纯化制备方法，主要包括如下工艺步骤:
1、将50L新鲜兔血按16:1的比例加入4.0%的枸橼酸钠(柠檬酸钠)，搅匀。
[0010]2、连续流离心机离心，离心力约为400g。离心上清为血浆，沉淀物为血球等细胞。
收集沉淀。
[0011 ] 3、将收集的沉淀用4倍生理盐水冲洗，连续流4000转离心，重复三次，去除血红蛋白。然后去离子水等倍体积搅拌溶血。
[0012]4、向溶血液中加入等倍体积95%的预冷乙醇，0.2倍体积的预冷氯仿。搅拌20分钟后静置I小时，然后4000转连续流离心，取上清，紫外分光光度计测定吸光度。
[0013]5、将上清加热到60°C，保温15分钟，然后迅速降温至室温，4000转连续流离心，收集上清，测定吸光度。然后生理盐水中冷却，加入预冷丙酮，搅拌，收集沉淀，然后用去离子水溶解。
[0014]6、滤出液脱盐:G25脱盐层析
层析柱450*600，填料为DE32，装填高度为50cm，约需要80L的G25填料。Buffer:
2.5mM PBS, pH 5.2。
[0015](I):将Buffer通过进液管路I抽取，平衡层析柱，直至pH为5.2，且紫外检测器信号为平。
[0016](2):将20L的滤出液通过上样管路上样，待上样完成后切至进液管路I。
[0017](3):当紫外检测器检测到蛋白流出时，切换至收集管路1，直至紫外检测器信号值为其峰值的1/10，切换至废液，直至紫外检测器信号为平，重复上样完。
[0018](4):1M NaOH通过进液管路2抽取，对层析柱进行CIP (在位清洗)，直至pH为13或以上且紫外检测器信号为平，并保持30min。
[0019](5):ddH20通过进液管路3抽取，冲洗层析柱，直至其pH值为7或以下且紫外检测器信号为平。
[0020](6):20%乙醇通过进液管路4抽取，冲洗层析柱，约1.5个柱体积。冷沉淀:将G25脱盐柱的收集液置于4°C的环境中过夜，其会析出大量的沉淀物，该沉淀物成分主要为超氧化物歧化酶SOD。
[0021]7、离心:将冷沉淀的溶液在4°C的条件下，15，OOOg的离心力，离心约30min，沉淀上清分开收集。
[0022]8、将沉淀用5mM HAC-NaAC溶液清洗2次后在用1mM pH为7.0的PB溶液重溶，将重溶的超氧化物歧化酶通过0.45um的滤纸过滤。
[0023]9、DE32离子交换层析:层析柱100*300，填料为DE32，装填高度为10cm，约需要
0.6L 填料。Buffer A:10mM PB，pH 7.0 !Buffer B:Buffer A +250mM NaCl。
[0024](I):将Buffer A通过进液管路I抽取，平衡层析柱，直至pH为7.0，且紫外检测器信号为平。
[0025](2):将所有超氧化物歧化酶通过上样管路上样，待上样完成后切至进液管路I。
[0026](3):继续用Buffer A冲洗层析柱直至紫外检测器信号为平。
[0027](4):将Buffer B通过进液管路2抽取，当紫外检测器检测到蛋白流出时，切换至收集管路1，直至紫外检测器信号值为其峰值的1/10，切换至废液，直至紫外检测器信号为平。
[0028](5):1M NaOH通过进液管路3抽取，对层析柱进行CIP (在位清洗)，直至pH为13或以上且紫外检测器信号为平。
[0029](6) =Buffer B通过进液管路2抽取，冲洗层析柱，直至其pH值为7或以下且紫外检测器信号为平。
[0030](7):20%乙醇通过进液管路4抽取，冲洗层析柱，约1.5个柱体积。
[0031]10、超滤:超滤器的截留分子量为10KD，膜面积为200cm2。
[0032](I):将超滤系统按操作手册安装好，并在IBar的压力下运行5min，检查膜包与夹具接触处是否漏液。
[0033](2):将膜包用0.1M NaOH冲洗30min后用水冲洗直至pH约为7，再用1mMPB+250mM NaCl 溶液冲洗。
[0034](3):将进液口放入SOD洗脱液中，回流端I和滤出端关闭，打开回流端管路2管路，全系统运行5min后，打开滤出端，并调节滤出端阀门，使滤出端流速约为回流端的1/10且跨膜压为IBar。
[0035](4):待SOD洗脱液体积约为之前的1/10时，关闭超滤系统，并尽量将进液管路和回流管路中的SOD洗脱液收集。
[0036](5):将膜包用0.1M NaOH冲洗30min后用水冲洗直至pH约为7，将膜包取出，置于保存液中。
[0037]11、将超滤后的SOD洗脱液在4°C的条件下，15000g的离心力，离心约30min，收集上清，即为SOD原液。
【主权项】
1.兔血中超氧化物歧化酶的纯化制备方法，主要包括如下工艺步骤: (1)、将50L新鲜兔血按16:1的比例加入4.0%的枸橼酸钠或柠檬酸钠，搅匀； (2)、连续流离心机离心，离心力约为400g;离心上清为血浆，沉淀物为血球等细胞，收集沉淀； (3)、将收集的沉淀用4倍生理盐水冲洗，连续流4000转离心，重复三次，去除血红蛋白；然后去离子水等倍体积搅拌溶血； (4)、向溶血液中加入等倍体积95%的预冷乙醇，0.2倍体积的预冷氯仿；搅拌20分钟后静置I小时，然后4000转连续流离心，取上清，紫外分光光度计测定吸光度； (5)、将上清加热到60°C，保温15分钟，然后迅速降温至室温，4000转连续流离心，收集上清，测定吸光度；然后生理盐水中冷却，加入预冷丙酮，搅拌，收集沉淀，然后用去离子水溶解； (6)、上述沉淀用去离子水溶解后，采用G25脱盐柱层析；脱盐层析所得冷沉淀物的主要成分为超氧化物歧化酶； (7)、离心:将冷沉淀的溶液在4°C的条件下，15，OOOg的离心力，离心约30min，沉淀、上清分开收集； (8)、将沉淀用5mMHAC-NaAC溶液清洗2次后在用1mM pH为7.0的PBS溶液重溶，将重溶的超氧化物歧化酶通过0.45um的滤纸过滤； (9)、将过滤后溶液经DE32离子交换层析；然后再经超滤； (10)将超滤后的SOD洗脱液在4°C的条件下，15000g的离心力，离心约30min，收集上清，即为SOD原液。
【专利摘要】本发明属于生物蛋白技术领域，具体涉及兔血中超氧化物歧化酶的纯化制备方法。该方法主要包括如下工艺步骤：将兔血中加入抗凝剂，离心收集沉淀；将沉淀用生理盐水冲洗，离心，去除血红蛋白；去离子水等倍体积搅拌溶血；向溶血液中加入等倍体积95%预冷乙醇，0.2倍体积的预冷氯仿；搅拌，离心，取上清；上清加热到60℃，保温15分钟，然后速降至室温，离心，取上清；生理盐水中冷却，加入预冷丙酮，搅拌，取沉淀，用去离子水溶解；脱盐层析；沉淀用HAC-NaAC溶液清洗2次后用PBS溶液重溶，再通过0.45um的滤纸过滤；离子交换层析；超滤；SOD洗脱液在4℃的条件下离心，取上清，即为SOD原液。本发明的方法操作简单，提取的超氧化物歧化酶纯度高。
【IPC分类】C12N9/02
【公开号】CN105039273
【申请号】CN201510407291
【发明人】张姝倩, 葛安山, 孙莎莎, 陈宴霞, 宋玉龙
【申请人】青岛康大食品有限公司, 青岛中创生物科技有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月13日