参与西瓜葫芦素e合成的基因簇及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及参与西瓜萌芦素E合成 的基因簇及其应用。
【背景技术】
[0002] 西瓜的苦味是由一类称为萌芦素E的三萜化合物导致的。西瓜果实中积累萌芦素 E会严重影响西瓜的口感及品质。前期研究利用基因组学、分子生物学、生物化学等手段揭 示了由9个基因参与的黄瓜苦味物质萌芦素C的合成途径，其中包括1个氧化角鲨烯环化 酶Bi，7个细胞色素P450基因和1个乙酰基转移酶基因，并利用生物化学方法完全阐明了 四步反应，其对于萌芦科植物中其他类型的萌芦素生物合成路径的研究具有重要的指导意 义，也为植物中其他三萜化合物的通路解析提供了新思路。萌芦素具有抗虫作用，并且医学 研究证明萌芦素能够抑制多种癌细胞生长，目前萌芦素主要从植物中提取获得，不能通过 异源生物合成。而西瓜中参与萌芦素E生物合成的基因还没有被克隆，萌芦素E生物合成 路径的解析将为开发新型抗癌药物提供基础。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供参与西瓜萌芦素E合成的基因簇及其应用。
[0004] 为了实现本发明目的，本发明提供参与西瓜萌芦素E合成的蛋白，包括 Cla007077、Cla007078、Cla007079、Cla007080、Cla007081、Cla007082、Cla008354 和 Cla008355,它们的氨基酸序列分别如SEQIDNo. 1-8所示。
[0005] 本发明还提供参与西瓜萌芦素E合成的基因簇，所述基因簇由以下8个基因组 成，Cla007077、Cla007078、Cla007079、Cla007080、Cla007081、Cla007082、Cla008354 和 Cla008355,它们的核苷酸序列分别如SEQIDNo. 10-17所示。
[0006] 本发明还提供含有所述参与西瓜萌芦素E合成的基因簇的载体、工程菌及宿主细 胞。
[0007] 本发明还提供所述参与西瓜萌芦素E合成的基因簇在调控西瓜苦味合成中的应 用。
[0008] 本发明还提供所述参与西瓜萌芦素E合成的基因簇在调控萌芦素体外合成中的 应用。
[0009] 本发明还提供所述参与西瓜萌芦素E合成的基因簇在无苦味西瓜分子育种中的 应用。
[0010] 前期研究中利用基因组学、分子生物学、生物化学等手段揭示了由9个基因参与 的黄瓜苦味物质萌芦素C的合成途径，以此为基础，通过将西瓜中的环化酶基因与黄瓜中 的氧化角鲨烯环化酶基因Bi进行进化树分析，找到了一个与黄瓜Bi基因同源性最高的基 因Cla007080(Bi)，利用酵母表达体系证明了该基因编码萌芦二烯醇合成酶，是萌芦素合 成的关键酶。萌芦二烯醇还需要进一步被氧化和乙酰化才能生成萌芦素。为了解析萌芦 素E合成的其他步骤，利用比较基因组学方法在西瓜基因组中找到了一个类似于黄瓜萌 芦素C合成的基因簇：由 6 个P450 基因（Cla007077、Cla007078、Cla007079、Cla007082、 Cla008354 和Cla008355)、l个乙酰转移酶基因（Cla007081)和 1 个Bi基因（Cla007080) 组成。这8个基因在西瓜各个组织中的表达状态非常相似，只在根中大量表达。此外，除了 基因Cla008354和Cla008355以外，其他基因与Bi基因均位于6号染色体57kb的范围内， 形成一个类似基因簇的结构。目前，以基因簇的形式参与重要次生代谢产物合成在高等植 物中被广泛发现，因此推测这8个候选基因很可能参与了萌芦素E的合成。
[0011] 进一步利用酵母表达体系，在酵母中表达这些候选基因，用UPLC-Q-T0F仪分析 产物的精确分子量，推测可能发生的氧化反应产物，解析萌芦素E合成中间步骤。首 先，在表达Bi、还原酶CPR和Cla008354的酵母中发现了两个特异产物，一个分子量为 441. 3727[M+H]，另一个为 457. 3676[M+H]，经过MS、MS/MS结果分析推测Cla008354 为多 功能P450,在萌芦二烯醇合成中先羰基化，再羟基化。进一步将该产物从酵母中纯化分 离出来，利用核磁共振（NMR)解析其结构，发现萌芦二烯醇的11号碳原子先发生羰基化 (C3QH4S02)，然后在20号碳原子上发生羟基化（C3(]H4S03)，进而证Cla008354可连续氧化萌芦 二烯醇，催化萌芦素E合成的第二步和第三步。由于基因Cla008354与Cla008355高度同 源，经过相同的方法验证基因Cla008355也具有相同的功能，即也能够催化萌芦二烯醇的 11号碳原子先发生羰基化（C3(]H4S02)，然后在20号碳原子上发生羟基化（C3(]H4S03)。继续利 用酵母表达体系，表达更多的候选基因，利用类似的方法，仅在表达Bi、CPR、Cla008354 (或 Cla008355)和Cla007079的酵母提取物中发现分子量为473. 3625[M+H]的特异产物，推 测上一步催化产物被Cla007079羟基化，进一步将该产物从酵母中纯化分离出来，利用 核磁共振（NMR)解析其结构，发现在2号碳原子上发生了羟基化（C3(]H4S04)，进而证明了 Cla007079催化萌芦素E合成的第四步。
[0012] 本发明首次在西瓜基因组中发现参与萌芦素E合成的基因簇，共由8个基因组成， 其中6个基因均位于6号染色体57kb的范围内。利用酵母体系成功解析了萌芦素E合成 的第1至第4步反应。本发明进一步揭示了西瓜苦味形成的分子机制，为无苦味西瓜育种 提供了理论依据和分子辅助育种目标，可用于大规模筛选育种材料，大大加快高品质西瓜 的育种进程；同时还为萌芦素的体外人工合成提供了宝贵经验，本发明可替代传统的从植 物材料中提取苦味素（萌芦素）的方法，利用合成生物学从而实现体外合成苦味素。
【附图说明】
[0013] 图1为本发明通过比较基因组学以及RNA-Seq数据分析，从西瓜基因组中发现与 苦味素（萌芦素E)合成相关的基因簇。
[0014] 图2为本发明利用UPLC-Q-T0F检测参与苦味素合成第二步和第三步反应的结果； 其中，A为UPLC-Q-T0F检测到的Cla008354和Cla008355的特异产物，B为该特异产物的 MS/MS检测结果，C为核磁共振NMR结构解析结果。
[0015] 图3为本发明利用UPLC-Q-T0F检测参与苦味素合成第四步反应的结果；其中，A 为UPLC-Q-T0F检测到的Cla007079的特异产物，B为该特异产物的MS/MS检测结果，C为核 磁共振NMR结构解析结果。
【具体实施方式】
[0016] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0017] 实施例1参与西瓜萌芦素E合成的基因簇的挖掘与获得
[0018] 1、基因簇的挖掘
[0019] 以黄瓜苦味物质萌芦素C合成基因簇研究为基础，利用比较基因组学方法，在西 瓜基因组中找到了一个类似于黄瓜萌芦素C合成的基因簇，共找到8