出芽短梗霉udpg焦磷酸酶、编码基因、载体及应用
【专利说明】出芽短梗霉UDPG焦磷酸酶、编码基因、载体及应用 (一）技术领域
[0001] 本发明涉及一种出芽短梗霉UDPG焦磷酸酶、编码基因、载体及在提高出芽短梗霉 胞外多糖产量中的应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 出芽短梗霉是一种重要的工业微生物，能够生产多种胞外多糖。包括聚苹果酸， 0-1，3葡聚糖和普鲁兰多糖。
[0003] 普鲁兰具有良好的生物相容性和可降解性，可广泛应用于生物材料，食品包装，医 药制造，化妆品和农业环保领域，具有广泛的应用前景。
[0004] 聚苹果酸是一类具备生物可降解性，生物可吸收性及相容性的高分子，可作为生 物医用材料广泛应，用于药物释放系统和组织工程等领域。
[0005]P-1，3葡聚糖是一种具有抗肿瘤活性的生物多糖，能够抑制多种肿瘤细胞的生 长，并促进其细胞凋亡，提高荷瘤裸鼠的生存能力，在医药领域具有巨大的应用潜力。
[0006] 短梗霉是普鲁兰多糖和聚苹果酸的主要工业生产菌株，普鲁兰高产菌株的产率能 够达到80g/L发酵液。出芽短梗霉具有很强的胞外多糖合成能力，应该与其合成途径酶 基因有密切关系。但是关于出芽短梗霉多糖的合成途径及其相关基因却始终未有准确阐 明。根据已有的研究结果总结出以下可能的多糖的合成途径：6_磷酸葡萄糖在磷酸葡萄糖 变位酶的催化下生成1-磷酸葡萄糖和UMP(尿苷一磷酸），在UDPG焦磷酸酶（UGPPase，EC 3. 6. 1. 45)的催化下而合成UDPG(尿苷二磷酸葡萄糖），而UDPG是多糖合成的共同前体分 子，接下来由不同的糖基转移酶将UDPG聚合成不同的多糖，例如普鲁兰多糖和0-1，3葡聚 糖。但是上述途径只是假设推论，到目前为止没有检索到任何分子水平的关于普鲁兰多糖 合成途径的研究成果。出芽短梗霉UDPG焦磷酸酶的研究，对于从分子水平阐明其胞外多糖 的合成途径，具有重要价值。本发明首次从出芽短梗霉中克隆得到胞外多糖合成相关焦磷 酸酶，对于实现代谢工程技术改造出芽短梗霉，提高普鲁兰和0 -1，3葡聚糖多糖的产量具 有重要意义。 (三）
【发明内容】
[0007] 本发明目的是提供一种能够提高出芽短梗霉胞外多糖产量的酶，即出芽短梗霉 UDPG焦磷酸酶，同时提供了出芽短梗霉UDPG焦磷酸酶编码基因及重组载体以及出芽短梗 霉UDPG焦磷酸酶在提高出芽短梗霉胞外多糖产量中的应用。
[0008] 本发明采用的技术方案是：
[0009] 本发明提供一种出芽短梗霉UDPG焦磷酸酶，所述酶的氨基酸序列为SEQIDNO. 1 所示。
[0010] 本发明还提供一种所述出芽短梗霉UDPG焦磷酸酶编码基因，所述编码基因的核 苷酸序列为SEQIDN0. 2所示，所述编码基因的cDNA序列为SEQIDN0. 3所示。
[0011] 本发明涉及一种由所述出芽短梗霉UDPG焦磷酸酶编码基因构建的重组载体。所 述载体的构建是将SEQIDNO. 3所示cDNA序列连入pET28a载体的Ndel和Xhol酶切位点 而获得。
[0012] 本发明还涉及一种所述出芽短梗霉UDPG焦磷酸酶在提高出芽短梗霉胞外多糖产 量中的应用，具体所述的应用是将出芽短梗霉UDPG焦磷酸酶编码基因转化入出芽短梗霉 中，从而获得提高出芽短梗霉胞外多糖产量的出芽短梗霉。优选所述出芽短梗霉为出芽短 梗霉NRRL12974。所述胞外多糖为普鲁兰多糖和0-1，3葡聚糖。
[0013] 本发明所述出芽短梗霉UDPG焦磷酸酶编码基因转化入出芽短梗霉的方法为：以 出芽短梗霉NRRL12974的cDNA为模板，在上游引物和下游引物作用进行PCR扩增，PCR扩 增条件为，94°C预变性51min;94°C变性50s，60°C退火50s，72°C延伸2min，30个循环；25°C 保温lOmin;扩增产物通过SalI和NotI酶切连入经同样酶切的pAPE16载体的多克隆 位点，获得重组质粒pAPE16-UGPPase;使用引物NS2和NS7,以重组质粒pAPE16-UGPPase为 模板，采用PCR的方法获得带有潮霉素抗性基因和UDPGase双表达盒的DNA片段，然后通过 电击法使线性片段转化原始菌出芽短梗霉NRRL12974,通过潮霉素抗性平板筛选，获得在基 因组上携带有外源UDPGase拷贝和潮霉素抗性基因拷贝的重组工程菌，然后将重组工程菌 进行发酵培养，获得普鲁兰和0 -1，3葡聚糖产量提高的菌株。
[0014]上游引物：5 ' -CCGCTCGAGATGGAAAAGCAACGCA-3 '；
[0015]下游引物：5 ' -ATAAGAATGCGGCCGCTCAGAGTTCCAATATC-3 '
[0016]NS2 引物：5' -CTCAAAGATTAAGCCATGCATGT-3'
[0017]NS7 引物：5' -TTCACCTACGGAAACCTTGT-3'。
[0018] 本发明的意义在于首次从出芽短梗霉中克隆了参与胞外多糖合成的UDPG焦磷酸 酶编码基因的cDNA和核苷酸序列，氨基酸序列比对最近似的焦磷酸酶的相似度为黑曲霉 的UDPG焦磷酸酶，相似度仅为54 %。焦磷酸酶经过大肠杆菌重组表达后的重组蛋白，经过 活性测定，能够在ATP存在条件下以1-磷酸葡萄糖和焦磷酸钠为底物合成前体分子：UDPG。 上述性质说明这个酶是一个全新的焦磷酸酶。首次利用基因工程技术在出芽短梗霉原始菌 中过表达UDPG焦磷酸酶，重组短梗霉普鲁兰多糖的产量能够提高32%，0 -1，3葡聚糖产量 能够提高55%。从分子角度证明UDPG焦磷酸酶参与两种胞外多糖的合成，为利用代谢工程 技术改造出芽短梗霉的胞外多糖合成途径提供技术基础和方法指导。 (四）【附图说明】
[0019] 图1为UDPG焦磷酸酶重组蛋白的SDS-PAGE电泳图，M:TAKARA蛋白分子量标准 (low)，l:BL21(DE3)-28aO.lmMIPTG25°C诱导，2:BL21(DE3)-UDPG-28a未诱导破碎后全 细胞，3 :BL21(DE3)-UDPG-28aO.ImMIPTG25°C诱导破碎后全细胞，4 :BL21(DE3)-UDPG-28a O.lmMIPTG25°C诱导破碎后上清，5 :BL21(DE3)-UDPG-28aO.lmMIPTG25°C诱导破碎后 沉淀，6出121(0￡3)-1]〇?6-283〇.111111?16 25°(：诱导纯化，上样量1〇1^。
[0020] 图2温度对UDPG焦磷酸酶的影响曲线图。
[0021 ] 图3PH值对UDPG焦磷酸酶的影响曲线图。
[0022] 图4ATP对UDPG焦磷酸酶的影响曲线图。
[0023] 图5UDPG焦磷酸酶对不同磷酸葡萄糖，磷酸果糖的酶活性曲线图。
[0024] 图6短梗霉整合表达载体pAPE16图谱。
[0025] 图7带有UDPG焦磷酸酶cDNA基因片段的短梗霉整合表达载体pAPE16_UGPPase 图谱。
[0026] 图8双表达盒DNA片段的琼脂糖电泳图，泳道1为DNAmarker泳道2-7为重组质 粒PCR扩增的6个平行样。
[0027] 图9短梗霉工程菌与原始菌多糖产量比较柱形图。 (五）【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0029] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0030] 本发明通过生物信息学分析，根据UDPG焦磷酸酶基因的保守序列，设计兼并引 物，从出芽短梗霉中克隆得到胞外多糖聚合途径中的UDPG焦磷酸酶的核心片段，采用IPCR 方法成功克隆到了cDNA全长基因，并纯化该酶研究其酶学特性及功能验证。
[0031]实施例1、UDPG焦磷酸酶基因的克隆
[0032] (1) UDPG焦磷酸酶基因核心片段
[0033] 利用生物信息学分析NCBI中已报道的真菌UDPG焦磷酸酶基因序列（Trichoderma reeseiQM6a,XM_006960998. 1；AspergillusnigerCBS513. 88,XM_001395134. 2 ； FusariumgraminearumPH-1,XM_011317898. 1；Emericellanidulans,AY850189. 1 ； Podosporaanserina，F0904936. 1)，使用DNAMAN软件对氨基酸序列进行比对后，找出其中 保守区，设计简并引物，上游引物为：Apl90F:5'-CCNTTYGTNGCNGAYGC-3'（SEQIDN0. 5);下 游引物为4?4401?:5'40^^^0^0：訂6訂6-3'（5￡〇10勵.6)。然后以出芽短梗霉冊此 12974(公开文献来源：JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology. 2011Sep; 38 (9) : 1211-8.doi: 10. 1007/sl0295-010-0899-y.)基因组为模板，进行PCR扩增，扩增条 件为：94°C预变性5min;循环内94°C变性30sec，50°C退火30sec，68°C延伸30S，32个循环； 68°C后延伸10min。PCR产物经琼脂糖电泳，回收目的片段，回收产物加A试剂盒处理后，回 收片段连接TVector，经测序获得SEQIDN0. 4所示核苷酸序列，记为UDPG焦磷酸酶基因 核心片段，该片段为750bp的核苷酸片段。
[0034] ⑵UDPG焦磷酸酶基因核苷酸序列
[0035] 然后根据IPCRdnversePCR)原理，设计扩增UDPG焦磷酸酶基因核苷酸序列（SEQ IDN0. 2)的引物，模板为出芽短梗霉NRRL12974基因组DNA。
[0036]正向引物：5'-GAGTTCAAGTCGATCAAGAAATTCA-3'（SEQIDN0. 7);
[0037]反向引物：5'-AGAGITGGCCGACTTGGGGGCGGGGA-3'（SEQIDNO. 8)。
[0038]PCR扩增条件为：94°C预变性 5min;94°C变性 30s，56°C退火 30s，68°C延伸 3min， 30个循环；68°C后延伸5min;15°C保温5min。将扩增产物与PMD19-TVector连接，转化 E.coliJM109感受态细胞，筛选获得阳性重组子，然后测序获得1901bp的序列，如SEQID NO. 2所示，即UPDPG焦磷酸酶基因的核苷酸序列。
[0039] 实施例2构建UDPG焦磷酸酶的大肠杆菌重组表达载体
[0040] (1)用酵母总RNA提取试剂盒（购自BI0SCI公司，货号为RT001)提取出芽短梗霉 NRRL12974的总RNA，然后用反转录酶试剂盒（购自BI0SCI公司，货号为RT002)合成cDNA 第一条链，并以此为模板，进行PCR扩增，
[0041]上游引物：5' -ATGTCCTCCGAGATGGCAA-3'（SEQIDN0. 9);
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