一种耐高糖耐碱的β-葡萄糖苷酶的表达及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种0 _葡萄糖苷酶，它能够被葡萄糖显 著提高酶活，能够在碱性条件下保持优良的稳定性。
【背景技术】
[0002] 0 -葡萄糖苷酶（0 -glucosidase，EC3. 2. 1. 21)，又称0 -D-葡萄糖苷葡萄糖水 解酶，是一种外切水解酶类。它能够水解结合于末端非还原性的0-D-葡萄糖苷键，广泛的 应用在食品风味物质的释放、纤维素降解和日用化工业中。这些应用中，葡萄糖常常是水解 产物之一，但是葡萄糖也是大部分葡萄糖苷酶的抑制剂。因此，挖掘高葡萄糖耐受性的 0 _葡萄糖苷酶一直是研究的热点。
[0003]目前的文献报道中一共有约四十多个微生物来源的e-葡萄糖苷酶具有不同程 度的葡萄糖耐受性。葡萄糖达到1.0m〇l/L以上，酶活依然可以不受到抑制的葡萄糖 苷酶仅有 3 个，分别来自 Bacillus haloduransC_125(Xu et al.Curr Microbiol 2011， 62:833-839)和 2 个不同的宏基因组文库（Uchiyama et al.J Biol Chem 2013,288: 18325-18334 ;Biver et al.J Ind Microbiol Biotechnol 2014,41:479-488)。但是 Uchiyama报道的0 -葡萄糖苷酶同时具有高效的转糖苷活性，该酶的高葡萄糖耐受性是由 于葡萄糖可以被转化成其它产物。我国专利中有7篇公布了能耐受葡萄糖的葡萄糖苷 酶及突变体，但是没有能在1. 〇m〇l/L葡萄糖存在时酶活依然不受影响的。
[0004] 黄热厌氧芽抱杆菌云南亚种（Anoxybacillus flavi thermus subsp. yunnanensis)是本实验室分离鉴定的新亚种（Dai et al.FEMS Microbiol Lett 2011， 320:72-78)。从菌株E13T和P⑶Y12中分别克隆获得了 葡萄糖苷酶基因。这两个酶的 氨基酸序列相似性为98. 4%。与已经有文献报道的葡萄糖苷酶（Breves et al.Appl Environ Microbiol 1997,63:3902-3910)最高序列相似性仅为60%。其中菌株E13T的 葡萄糖苷酶的氨基酸序列在NCBI的序列号为AGS46809. 1。但是，这两个葡萄糖苷 酶的野生型基因在大肠杆菌中都无法表达出有活性的酶。由于来源菌株E13T的葡萄 糖苷酶基因是完全观察不到表达条带，而来源菌株PGDY12的0 -葡萄糖苷酶基因是表达出 无活性的包涵体，因此选择来源菌株P⑶Y12的0 -葡萄糖苷酶进行了进一步优化研究。
[0005] 本发明通过优化基因序列和探索诱导表达条件，获得了一个能在大肠杆菌中表达 出活性的葡萄糖苷酶基因，阐明了活性表达的核心技术要点。该葡萄糖苷酶的 葡萄糖耐受性非常好，且没有转糖苷活性。低于1. 75mol/L的葡萄糖都能增强酶活，存在 2. 0m〇l/L的葡萄糖时，酶活依然保留了 76 %。酶的碱稳定性也很好，pH9. 0和10. 0孵育24h 后依然保持99 %和97 %的酶活。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种耐高糖耐碱的0 _葡萄糖苷酶，以弥补现有技术存在的 不足之处。
[0007] 本发明提供了编码所述葡萄糖苷酶的基因序列，序列为SEQIDNO:1 ;该基因 序列编码的氨基酸序列为SEQIDNO:2。
[0008] 本发明提供的0-葡萄糖苷酶氨基酸序列（SEQ ID NO :2)是来自黄热厌氧芽孢杆 菌云南亚种TOGY12,与在NCBI上面已经公布的黄热厌氧芽孢杆菌云南亚种E13T中0 -葡 萄糖苷酶的氨基酸序列（NCBI序列号AGS46809. 1)有7个氨基酸不相同，这二者的序列相 似性为98. 4%。此外，黄热厌氧芽孢杆菌云南亚种E13T中葡萄糖苷酶未作功能鉴定。
[0009] 本发明提供的葡萄糖苷酶基因（SEQID NO: 1)是依据大肠杆菌密码子偏好性 进行了优化，由生物公司合成。该基因序列与黄热厌氧芽孢杆菌云南亚种E13T中葡萄 糖苷酶的基因序列相似性仅为74. 9%。此外，该0 -葡萄糖苷酶的野生的未优化的基因序 列在大肠杆菌无法表达出有活性的蛋白。
[0010] 本发明提供了表达上述葡萄糖苷酶的重组质粒，是将基因序列为SEQID N0 :1 的核苷酸片段插入到表达载体pET22b中。
[0011] 本发明提供了携带表达上述P _葡萄糖苷酶的大肠杆菌重组菌。
[0012] 本发明提供了上述重组菌表达出P -葡萄糖苷酶的低溶氧诱导表达条件，在该条 件下，能表达出可溶性的具有催化活性的葡萄糖苷酶。在提供的表达条件中，低溶氧 (D0 < 10% )是关键技术参数。可以通过多种途径实现低溶氧的控制，比如：降低转速、增 加装液量、减少通气量等等。
[0013] 本发明提供了上述0 _葡萄糖苷酶的最优反应条件和反应条件范围。该酶的温度 范围为0-70°C，最适温度为50°C。温度稳定性非常好，50°C时的半衰期为13h。该酶的pH 范围为4. 5-10. 5,最适pH为7. 5，pH 8.0和9.0时保持最适pH时93和53%酶活。纯化的 0 _葡萄糖苷酶比活为62. 2U/mg。
[0014] 与已知的葡萄糖苷酶相比，本发明提供的葡萄糖苷酶的特色是：⑴低于 1. 75mol/L的葡萄糖都能增强酶活；当葡萄糖浓度为0. 4mol/L时，酶活达到最高，为无葡 萄糖存在时的2. 2倍；(2)酶的碱稳定性很好，在pH 8. 0,9. 0和10. 0孵育24h后依然保持 92%，99 %和97%的酶活。
【附图说明】
[0015] 图1表示了本发明的P-葡萄糖苷酶的pET22b-glA2质粒图谱。
[0016] 图2表示了本发明的0 -葡萄糖苷酶的表达和纯化后蛋白的SDS-PAGE图。1为 大肠杆菌BL21(DE3)空细胞的全菌蛋白；2为含有pET22b-glA2质粒的大肠杆菌BL21(DE3) 诱导表达后的全菌蛋白；4为纯化的葡萄糖苷酶glA2。
[0017] 图3表示了本发明的葡萄糖苷酶的反应温度曲线。
[0018] 图4表示了本发明的葡萄糖苷酶的反应pH曲线。
[0019] 图5表示了本发明的葡萄糖苷酶在50°C的温度稳定性曲线。
[0020] 图6表示了本发明的0 -葡萄糖苷酶在碱性条件下的稳定性曲线。
[0021] 图7表示了本发明的葡萄糖苷酶在不同葡萄糖浓度下的酶活曲线。
【具体实施方式】
[0022] 下述实施例是为了更详细的解释本发明，而非限制本发明。
[0023] 实施例1
[0024] 0 -葡萄糖苷酶glA2的氨基酸序列的获得
[0025] 黄热厌氧芽孢杆菌云南亚种P⑶Y12的基因组DNA是按照Ezup柱式细菌基因组 DNA抽提试剂盒（上海生工生物科技有限公司）的使用说明来提取的。根据NCBI中黄热厌 氧芽孢杆菌云南亚种E13 T中0 -葡萄糖苷酶的基因序列设计PCR的上游引物和下游引物， 其序列分别为：5' -ATGCTTCAGITTCCGAAA-3' 和 5' -ITTAACTCCATGAITCATG-3'。以提取的基 因组为模板，进行PCR扩增得到的产物送上海生工生物科技有限公司进行基因测序，获得 黄热厌氧芽孢杆菌云南亚种P⑶Y12中0 -葡萄糖苷酶glA2的氨基酸序列和野生型基因序 列。
[0026] 实施例2
[0027] P_葡萄糖苷酶glA2的基因合成
[0028] 由于该葡萄糖苷酶的野生型基因序列在大肠杆菌表达出的蛋白是无活性的 沉淀形式的包涵体，因此，对野生型