用于筛查脊髓性肌萎缩症致病基因携带者的试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明特别涉及一种可用于筛查脊髓性肌萎缩症的致病基因携带者的试剂盒及 筛查方法，属于基因检测领域。
【背景技术】
[0002] 脊髓性肌萎缩症（SMA)，是一种神经肌肉疾病，属于常染色体隐性遗传病。每6000 名新生儿中就会有1名患有此病。临床表现为进行性、对称性的肌肉萎缩及肌无力。目前 为止SMA无特效治疗方法，预后主要与疾病的类型有关，I型患者一般生存期在2岁以内， II型患者生存期在5岁以内，而III型患者可存活至成人，其病情进展较慢，最终均死于呼吸 肌麻痹，或全身衰竭。
[0003] 目前发现的与SMA相关的基因有2个，即神经元凋亡抑制蛋白基因（neuronal apoptosis inhibitory protein，NAIP)和运动神经元存活基因(survival motoneuron， SMN)。NAIP基因定位于5ql3区，67%的SMA患者发生此基因突变，相比之下正常人群中突 变率仅2%。SMN基因也定位于5ql3区，约98%以上的SMA患者发生此基因突变。5ql3区 存在2个SMN等位基因：SMN1和SMN2,只有SMN1基因的纯合缺失才会导致SMA，而SMN2基 因的纯合缺失则出现在5%的正常人群中，因此作为基于人群范围的SMA致病基因筛查主 要针对SMN1基因进行检测即可，也无需对SMN2基因拷贝数进行检测。SMN1基因的缺失突 变，可引起脊髓前角运动神经元和脑干运动神经核变性，最终导致肌无力、肌萎缩。如此高 的携带率和发病率，而目前国内还没有针对此疾病的携带者的临床筛查。
[0004] 人群中SMA致病基因的携带者为1/40~1/50。携带者本人不发病，但是可以传 给下一代，其配偶如果也是基因携带者，则生育患儿的几率为1/4。通过对SMN1基因的拷 贝数进行定量检测，可筛查出95%以上的携带者。如果孕妇为携带者，则需对丈夫进行该 基因的检测，如夫妻双方均为携带者，则后代患病概率为1/4,则需在妊娠时进行产前诊断。 所以，通过检测SMA携带者并对其进行婚姻及生育指导，配合产前诊断，就可以从第一胎起 防止重型患儿出生，这不仅降低了本病的发病率，而且防止了不良基因在群体中播散。
[0005] 现有技术中所采用的SMA基因诊断方法主要有聚合酶链反应一限制性片段长度 多态性分析技术、等位基因特异性扩增、多重连接探针依赖性扩增技术（MLPA)等，但限制 性片段长度多态性分析技术、等位基因特异性扩增这些技术仅能定性的检测患者是否存在 SMN1基因纯合缺失，不能区分SMN1致病基因携带者。而MLPA虽能够进行携带者检测，其技 术成本高，仪器要求高，操作复杂，耗时长，不适合大规模的临床筛查。
[0006] 虽然诸如 CN 103789440A、CN 103614477A、CN104480206A 等专利还提出了利用荧 光PCR等技术检测脊髓性肌萎缩症相关基因突变的方案，但这些技术方案普遍存在准确性 低，可靠性差，成本高而不利于大规模人群筛查等缺陷。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种用于筛查脊髓性肌萎缩症 致病基因携带者的试剂盒。
[0008] 为实现前述发明目的，在本发明的一实施方案之中提供的一种用于人群范围筛查 脊髓性肌萎缩症致病基因携带者的试剂盒包括：
[0009] 以SMN1基因exon7为检测对象而设计的PCR扩增引物和第一 Taqman探针，
[0010] 以及，PCR反应试剂，包括聚合酶及缓冲溶液；
[0011] 其中，所述PCR扩增引物具有：
[0012] SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2 所示序列，
[0013] 或者，相对于SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2的核酸序列有一个或多个碱基缺失、替代 或插入且保留与SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2相同生物活性的核酸序列；
[0014] 所述第一 Taqman探针具有：
[0015] SEQ ID No. 3 所示序列；
[0016] 或者，相对于SEQ ID No. 3的核酸序列有一个或多个碱基缺失、替代或插入且保留 与SEQ ID No. 3相同生物活性的核酸序列。
[0017] 进一步的，所述试剂盒还包括以ALB基因exonl2为检测对象而设计的内参引物和 第二Taqman探针，所述内参引物具有SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5所示序列，所述第二Taqman 探针具有SEQ ID No. 6所示序列。
[0018] 需要说明的是，在本发明中，还可以选择其他表达水平趋于相对稳定的管家基因 作为内对照基因，例如 0 _actin(0 -肌动蛋白）、glyceraldehyde-3_phosphate(GAPDH，磷 酸甘油醛脱氢酶）和ribosomal RNA(rRNA，核糖体核糖核酸）。
[0019] 进一步的，所述第一 Taqman探针的一端连接有焚光基团，另一端连接有淬灭基 团。
[0020] 进一步的，所述第二Taqman探针的一端连接有焚光基团，另一端连接有淬灭基 团。
[0021] 其中，所述荧光基团包括FAM、TET或VIC等，但不限于此。
[0022] 其中，所述淬灭基团包括MGBNFQ等，但不限于此。
[0023] 例如，在一些实施例中，所述第一 Taqman探针的序列可以为：
[0024] 5' -VIC-CAGGGTTTCAGACAAA-MGBNFQ-3'
[0025] 或者，5 ' -FAM-CAGGGTTTCAGACAAA-MGBNFQ-3 '
[0026] 或者，5 ' -TET-CAGGGTTTCAGACAAA-MGBNFQ-3 '。
[0027] 进一步的，所述PCR反应试剂包括TaqMan通用PCR扩增预混试剂。
[0028] 本发明的另一重要目的在于提供一种采用前述任一种试剂盒筛查脊髓性肌萎缩 症基因携带者的PCR扩增方法。
[0029] 在一实施例中，该PCR扩增方法可以包括：
[0030] 将受检样本（即待检测的基因样本）与所述PCR扩增引物、第一 Taqman探针、内 参引物、第二Taqman探针、PCR反应试剂混合形成PCR反应体系，
[0031] 进行PCR扩增反应，包括：
[0032] 第一步变性反应，条件包括：温度为95°C -97°C，时间为5min-10min ;
[0033] 第二步PCR循环扩增反应，条件包括：退火和延伸温度为58-61°C，40个循环；
[0034] 以及，检测SMN1基因ex〇n7拷贝数，从而判别所述基因样本是否来源于脊髓性肌 萎缩症基因携带者。
[0035] 其中，PCR扩增反应的最佳反应条件包括：
[0036]第一步，50。(：、2111111，95。(：、1〇111111;
[0037] 第二步：95°C、15s，60°C、lmin，40 个循环。
[0038] 其中，每个样本可检测三复孔。
[0039] 进一步的，当计算的相对定量值为1. 7-2. 3之间时，定义为拷贝数为2,为正常人 (非脊髓性肌萎缩症基因携带者）；当相对定量值为〇. 7-1. 3之间时，定义为拷贝数为1，为 SMA致病基因携带者（脊髓性肌萎缩症基因携带者）；当相对定量值低于0.3时，定义为拷 贝数为〇,为SMA患者；当相对定量值为2. 5-3. 3之间时，定义为拷贝数为3时，为SMN1基 因多拷贝正常人。
[0040] 本发明针对SMN1基因exon7设计引物及探针，利用Taqman探针，检测脊髓性 肌萎缩症的基因携带者的SMN1拷贝数的变化，通过分析数据，绘制标准曲线来相对定量 SMNlexon7的拷贝数，从而区分SMA的携带者和非携带者。
[0041] 与现有技术相比，本发明的有益效果包括：藉由本发明的试剂盒，能够快速、方便、 相对定量遗传病SMA致病基因，且还具有高通量、重复性好、结果准确、可靠性好、成本低等 优点，可以大规模的的用于临床筛查，例如产前、婚前检测。
【具体实施方式】
[0042] 以下结合实施例对本发明的技术方案进行更具体的说明，但并不是对本发明技术 范围的限定。通过本说明书的记载，本领域技术人员可以容易的对本发明进行修饰/改变， 这些包含在本发明的技术范围内。
[0043] 本发明的一个方面公开了一种用于筛查脊髓性肌萎缩症基因携带者的试剂盒，其 包含PCR扩增引物和第一 Taqman探针，其中所述PCR扩增引物包括
[0044] 引物 SMN1-Ex7-1 :5' -AATGCTTTTTAACATCCATATAAAGCT-3'；
[0045] 引物 SMNl-Ex7-2: :5' -CCTTAATTTAAGGAATGTGAGCACC-3'；
[0046] 第一 Taqman 探针（或称特异性探针 Ml)为：5' -VIC-CAGGGITTCAGACAAA-MGBN FQ-3'。
[0047] 本发明的内参引物为表达水平趋于相对稳定的管家基因作为内对照基因，例如 0-actin(0-肌动蛋白）、glyceraldehyde-3_phosphate(GAPDH)(磷酸甘油醛脱氢酶）和 ribosomal RNA(rRNA)(核糖体核糖核酸），管家基因ALB基因exonl2等。优选的，内参基 因为ALB基因ex〇nl2,其引物和探针序列分别为：
[0048] 内参引物 ALB - 1 :5 ' -ATGCTGCACAGAATCCTTGGT-3 '
[0049] 内参引物 ALB - 2 :5 ' -TCATCGACTTCCAGAGCTGAAA-3 '，
[0050] 第二 Taqman 探针 M2 为：
[0051] 5 ' -FAM-AACAGGCGACCATGC-MGBNFQ-3 '。
[0052] 针对目的基因的引物和探针可以重新设计或者标记不同的荧光染料，序列可以有 单个碱基的差异，序列末端可以标记不同荧光基团和荧光淬灭基团，例如，可优选FAM、VIC