用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的生物标记物和荧光定量免疫pcr试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的生物标记 物和荧光定量免疫PCR试剂盒。
【背景技术】
[0002]乳腺癌新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy，NACT)又称术前化疗（primary chemotherapy)，指对非转移性肿瘤在局部治疗前进行的全身性、系统性的细胞毒性药物治 疗。该化疗方法不仅用于晚期乳腺癌并且越来越多的在早期病理状态下使用。NACT对可 手术治疗的乳腺癌患者有以下3点作用：（1)达到病理完全缓解（pathologic complete remission，pCR)患者的长期生存期明显提高。pCR是乳腺癌NACT的一个有效评估指标， 国际专家委员会推荐PCR定义为：新辅助化疗后，在乳腺和腋窝淋巴结均无浸润性癌组织 残留。而新辅助化疗后，只要原发肿块或/和转移病灶仍有浸润性癌组织残留即划分为非 pCR(Non_pathologic complete remission, NpCR)组。（2)降低肿瘤分期，局部进展期乳腺 癌经过新辅助化疗可以提高切除率和增加保乳机会。（3)术前药敏试验，防止耐药克隆的出 现。
[0003] NACT的临床运用已有30多年的历史，近年来虽然取得了较大进步，但随着研究的 深入也发现了亟待解决的问题和不足：约20%的乳腺癌患者对NACT不敏感，对于这部分患 者来说，如果NACT不敏感而疗程过长可能会延误局部治疗的时机，正是这个原因使部分医 师和患者在开展NACT时过分保守，pCR率低于10%。这就需要一种精确的疗效预测指标， 用以在化疗前预测NACT的疗效，避免治疗的盲目性。对NACT疗效有预测作用的相关指标 的研究有助于选择可能从NACT中获益的病人进行术前化疗，提高乳腺癌NACT的病理完全 缓解率和长期生存率，同时避免对化疗无效的病人进行不必要的术前化疗，以免延误其最 佳的治疗时机。NACT能在短期内获得乳腺癌对化疗方案敏感性的信息，这个特点决定了其 在预测辅助化疗的疗效方面具有更高的效率。因此乳腺癌NACT疗效预测体系的构建将使 我们在更短的时间内能够对更多新的化疗药物在乳腺癌辅助化疗中的疗效进行预测。
[0004] 由于目前尚无公认的可以有效预测乳腺癌NACT疗效的单一指标，因此联合多种 潜在的预测指标对乳腺癌NACT的疗效进行预测将有效提高预测的准确性。随着基因芯片 技术的成熟发展，使得我们可以对样本中数千个不同基因的表达同时进行有效的分析，以 获取大规模的基因表达信息。目前芯片技术已被应用于乳腺癌NACT的疗效预测。基因芯 片可以在乳腺癌活体组织或细胞系中检测一些已知的乳腺癌生物标志基因表达变化。所以 利用基因芯片技术可以获取治疗前乳腺癌活检标本的基因表达谱，然后与NACT后pCR的相 关性进行单因素分析，筛选出与NACT疗效相关的基因，同时联合那些被认为在单一状态下 预测价值较弱的基因，从而建立基因水平的多因素预测体系，对乳腺癌NACT的疗效进行有 效判断。
[0005] 目前已报道了多个与乳腺癌NACT疗效相关的基因芯片分析模型，其中最具代表 性的是MD Anderson肿瘤中心的含30个基因表达谱的乳腺癌NACT多基因分析预测模型， 对含蒽环类药物和紫杉醇类药物NACT后pCR的预测方面有很高的准确性，其敏感性和阴性 预测值显著高于相关的临床预测因子（92% vs. 61%)和（96% vs. 86%)，预测可获得pCR 的13例病人中有12例获得病理完全缓解，其预测价值可以与ER对内分泌治疗和Her2对 Herceptin治疗的预测价值相媲美。在此基础上该中心正在进行一项随机化的III期临床研 究来进一步验证该多基因预测模型在乳腺癌NACT疗效预测中的价值。
[0006] 然而，全基因组芯片用于筛选NACT相关的基因存在以下不足：芯片设计时，本身 覆盖了全基因范围内的基因探针以及肿瘤标本本身有很大的异质性结果导致芯片数据较 高的FDR(False Discovery Rate)值而难以鉴定到重要的基因。因此，分析NACT处理疗效 相关的有生物学意义的基因通路而非单个基因显得十分可行，并已证明与NACT的结果相 关。
[0007] 例如公告号为CN 103602746A的中国专利文献公开了一种预测乳腺癌新辅助化 疗疗效的生物标记物，该生物标记物是一种长非编码RNA，其在pCR组和NpCR组新鲜乳腺癌 组织中存在差异（P〈〇. 05)，在NpCR组乳腺癌组织中的表达显著高于pCR组。提示该生物 标记物可以用来预测新辅助化疗疗效，避免新辅助化疗盲目性。
[0008] 继续寻找能够有效预测乳腺癌新辅助化疗疗效的生物标记物对乳腺癌新辅助化 疗具有重要意义。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了细胞因子和细胞因子受体相互作用信号通路相关基因在作为用于 预测乳腺癌新辅助化疗疗效的生物标记物中的应用，该细胞因子和细胞因子受体相互作用 信号通路相关基因能够有效预测乳腺癌新辅助化疗疗效，避免新辅助化疗盲目性。
[0010] 细胞因子和细胞因子受体相互作用信号通路相关基因在作为用于预测乳腺癌新 辅助化疗疗效的生物标记物中的应用，所述细胞因子和细胞因子受体相互作用信号通路相 关基因为喊基序列如SEQ ID No. 1的CCL2基因、喊基序列如SEQ ID No. 2的CCR1基因、喊 基序列如SEQ ID No. 3的CXCL10基因、碱基序列如SEQ ID No. 4的CXCL11基因和碱基序 列如SEQ ID No. 5的IL2RG基因中的至少一种。
[0011] 本申请先收集乳腺癌患者进行新辅助化疗前的癌组织穿刺样本，再对患者进行新 辅助化疗，并根据疗效区分PCR和NpCR组；对新辅助化疗前收集的癌组织穿刺样本进行高 通量测序，分析筛选出在pCR和NpCR组中差异表达的基因，对筛选出的差异表达基因进行 pathway分析，分离得到与乳腺癌NACT疗效显著相关的五个细胞因子和细胞因子受体相互 作用信号通路（cytokine-cytokine receptor interaction pathway)相关基因，即 CCL2 基因、CCR1基因、CXCL10基因、CXCL11基因和IL2RG基因，这五个基因可作为生物标记物， 用于测乳乳腺癌NACT疗效。
[0012] 本发明还提供了用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的生物标记物，是碱基序列如 SEQ ID No. 1的CCL2基因、碱基序列如SEQ ID No. 2的CCR1基因、碱基序列如SEQ ID No. 3 的CXCL10基因、碱基序列如SEQ ID No. 4的CXCL11基因和碱基序列如SEQ ID No. 5的 IL2RG基因中的至少一种。
[0013] 本发明还提供了所述生物标记物在制备用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的PCR 试剂盒中的应用。
[0014] 作为优选，所述PCR试剂盒为荧光定量PCR试剂盒。
[0015] 本发明还提供了两种用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的荧光定量PCR试剂盒。
[0016] 其一：基于Taqman探针法的荧光定量PCR试剂盒，包括针对所述生物标记物设 计的特异性引物和Taqman探针，所述特异性引物和Taqman探针为以下①~⑤中的至少一 组：
[0017] ①针对CCL2基因设计的特异性引物和Taqman探针：
[0018] 上游引物：5' -CAAGCAGAAGTGGGTTCAGGAT-3'；
[0019] 下游引物：5'-TCTTCGGAGITTGGGmGC-3'；
[0020] Taqman 探针：5, -CATGGACCACCTGGACA-MGB-3'；
[0021] ②针对CCR1基因设计的特异性引物和Taqman探针：
[0022] 上游引物：5'-GACTCTTGGCACAGCATGGA-3'；
[0023] 下游引物：5'-GCCACCATTACAITCCCTCTCT-3'；
[0024] Taqman 探针：5' -TCACAGCCACTTGGGA-MGB-3'；
[0025] ③针对CXCL10基因设计的特异性引物和Taqman探针：
[0026] 上游引物：5'-TTCCTGCAAGCCAATTTTGTC-3'；
[0027] 下游引物：5'-TCTTCTCACCCTTCmTTCAITGT-3'；
[0028] Taqman 探针